Role nitrogen oxide and reactive nitrogen species in cancerogenesis of oral mucous membrane

Full Text

Изучение газового состава биологических жидкостей и выдыхаемого воздуха при воспалительных заболеваниях па- родонта и слизистой оболочки (СО), канцерогенезе полости рта (ПР) позволяет диагностировать, прогнозировать течение заболевания, оценить эффективность лечения, что стало основой для развития нового направления науки - метабо- ломики [1, 2]. Участие активных короткоживущих молекул, являющихся регуляторами на разных уровнях организации организма, позволяет понять глубинные механизмы развития заболевания. Одно из таких соединений - оксид азота (II) (NO). С момента открытия в организме человека NO прошло почти 30 лет, однако его роль в регуляции клеточных процессов при заболеваниях ПР остается темой для обсуждения. В данной статье мы рассмотрим роль NO и его активных метаболитов в канцерогенезе ПР. NO - короткоживущий (1-5 с), относительно стабильный, эндогенно продуцирующийся свободнорадикальный газ, который легко диффундирует в клетки через клеточные мембраны [3]. За счет неспаренного электрона NO обладает свободнорадикальной активностью при взаимодействии с кислородом, супероксид-радикалом, металлами с переходной валентностью. NO биоактивируется как нитроксильный ион (NO-) или нитрозил-катион (NO+) [4]. Эти химические соединения имеют короткий период полураспада. Однако при взаимодействии с тиолами, нитритами и другими промежуточными продуктами образуются стабильные биологические комплексы. В 1987 г. L.J. Ignarro и соавт. и S. Moncada и соавт. [5, 6] Обзор литературы независимо друг от друга открыли NO как фактор дилатации, продуцирующийся эндотелием. NO не имеет специфических рецепторов и проявляет биологическое действие за счет широкого спектра химических реакций. Выступает в качестве клеточно-сигнальной молекулы, антиинфекционного агента и антиоксидантного компонента. NO играет ключевую роль во многих физиологических процессах: вазодилатации, дыхании, иммунном ответе, миграции и апоптозе клеток [7-9]. NO продуцируют эндотелиальные, гладкомышечные, полиморфно-ядерные клетки, моноциты, тромбоциты [3]. NO синтезируется с помощью NO-синтазы (NOS) из аминокислоты L-аргинина эндотелия сосудов и молекулярного кислорода. Ко-факторами для NOS выступают HADF, FAD, FMN, BH4 [7]. Описано три изоформы NOS: нейрональная (nNOS), эндотелиальная (eNOS), индуцированная (iNOS). Клетки млекопитающих имеют три гена, кодирующие изоформы NOS с различной локализацией, регуляцией, каталитическими свойствами, чувствительностью к ингибиторам. Гомологичность среди изоформ NOS составляет 51-57%. Все изоформы NOS являются гемопротеинами и синтезируются в виде неактивных молекул [10]. nNOS впервые очищена и клонирована из нейронов. Ген этого фермента локализован в хромосоме 12q 24.2-24.31. eNOS впервые выявлена в эндотелиальных клетках. Кодируется экзоном гена 26, локализуется в хромосоме 7q 35-36. eNOS обеспечивает базальную продукцию NO. nNOS и eNOS также называются конституционными, поскольку экспрессируются постоянно в клетках нервной и эндотелиальной тканей соответственно. Их содержание зависит от концентрации кальция в тканях [7]. iNOS - индуцибильная, кальций-зависимая изоформа. Ее ген находится в хромосоме 17q 35- 17q 11. Обнаружена в эндотелиальных клетках СОПР, клетках слюнных желез [9]. Индукция iNOS обеспечивается различными иммунологическими стимулами в практически всех ядерных клетках млекопитающих. Активность iNOS регулируется геном p53, который в свою очередь воспринимает повышение NO в клетках и ингибирует iNOS по принципу обратной связи [7]. Это взаимоотношение имеет большое значение в развитии карцином СОПР. NO может оказывать прямой эффект на переход азотистых оснований в гене р53, что способствует потере депрессорной активности в отношении NOS и, как следствие, к увеличению экспрессии iNOS и усилению продукции NO клеткой, повреждению дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Также NO за счет косвенной реакции ингибирует активность каспаз через S-нитрозилирование цистеи- на тиолов, обеспечивая эффективную инактивацию апопто- за. TGFp, IL-4, IL-6, IL-8 и сам NO ингибируют экспрессию iNOS [7]. Избыточная экспрессия NOS приводит к генотоксично- сти, оказывая непрямую реакцию NO на гены [7, 11]. При воздействии iNOS происходит повышение локальной концентрации NO, что способствует повреждению ДНК за счет трех возможных механизмов: образования токсичных и мутагенных участков за счет NO, прямой модификации ДНК за счет активных форм азота (RNS, reactive nitrogen species), ингибирования механизмов репарации ДНК. Некоторые RNS способствуют разрыву цепей ДНК [7, 12]. Выделяют прямые и непрямые эффекты NO, которые различаются по локализации и концентрации эндо- и экзогенного NO [7]. Прямые эффекты обусловлены непосредственным взаимодействием NO c биологической мишенью. Они протекают достаточно быстро при низких концентрациях NO (< 1mM) и характерны при регуляции противовоспалительных эффектов NO и его антиоксидантных свойств [7]. В то время как непрямые реакции становятся значимыми при большей концентрации NO (> 1 mM) при его взаимодействии с супероксидом или O2, что способствует образованию RNS - три- оксиду азота (NO3), диоксиду азота (NO2), триоксиду диазота (N2O3), пероксинитриту (ONOO') [7]. RNS также поступают в организм человека при курении, употреблении алкоголя, некоторых продуктов питания, вдыхании различных летучих источников [12]. RNS за счет повреждения клеток индуцируют два типа химического стресса - нитрозилирующий и оксидативный [10, 13]. Эффекты RNS описаны ниже. В норме свободные радикалы нейтрализуются антиок- сидантной системой. Антиоксиданты присутствуют во всех тканях и жидкостях организма, защищая от эндогенного образования свободных радикалов. Антиоксидантная система представлена аскорбиновой кислотой, а-токоферолом, фла- воноидами, Р-каротином, мочевой кислотой, каталазой, глу- татионпероксидазой, глутатионом, супероксид-дисмутазой, небелковыми тиолами [14, 15]. Глутатион^-трансфераза - противоопухолевый энзим слюны - защищает от повреждения ДНК [16]. Мочевая кислота, наиболее важный антиоксидант слюны, оказывает до 85% антиоксидантной активности СОПР [17]. Выявление NO в различных диагностических средах используют в качестве диагностического и прогностического маркера, а также при разработке концепции лечения и профилактики опухолевых заболеваний [10]. При повышении продукции NO происходит повреждение белков, липидов и ДНК клетки. Высокая концентрация NO индуцирует апоптоз атипичных клеток СОПР in vitro [17]. NO регулирует провоспалительные медиаторы, которые в свою очередь влияют на трансформацию опухоли. Аутоокисление NO клеточных мембран приводит к формированию N2O3, что вызывает нитрозирование различных биологических мишеней и образование потенциально канцерогенных производных нитрозаминов и нитрозотиолов [12, 13]. Метаболизм нитрозаминов слюны основан на поглощении нитратов (NO3) в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. В слюнных железах метаболиты азота переходят из плазмы крови в слюну, а затем в полости рта - в NO2 [9]. Показано, что содержание NO2 в подчелюстной и околоушной железах не отличается от содержания в смешанной слюне в здоровой группе пациентов [18]. NO образует оксиды азота (NO2-, NO3-), которые ингибируют ДНК-лигазу, необходимую для восстановления поврежденной молекулы ДНК [4]. При взаимодействии NO и супероксида образуется ONOO-, окисляющий NH- и SH-группы ферментов - HADH-убихинон-оксидоредуктазы, сукцинат- убихинон-оксидоредуктазы, аконитазы и др. ONOO- также окисляет тиолы и тиоэфиры, остатки тирозина, гуанозин, повреждает углеводы, ДНК и инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеток [7]. Образование RNS и снижение антиоксидантной защиты организма приводит к аккумуляции нитрозилирующего стресса и поддержанию воспалительного процесса в ПР [13, 19]. Хроническое воспаление приводит к накоплению и активации лейкоцитов, увеличению продукции активных форм кислорода (ROS, reactive oxide species) и RNS, что способствует формированию предраковых заболеваний, таких как плоский лишай СОПР [14, 20]. Увеличение экспрессии NO приводит к увеличению клеток воспаления как в очаге поражения, так и в слюне, и в крови у пациентов с различными формами плоского лишая СОПР. Установлено значительное увеличение экспрессии NO и iNOS слюны при плоском лишае СОПР со здоровой группой [19, 20]. Доказано, что экспрессия NO2 в слюне увеличивается при всех формах плоского лишая СОПР [2]. При этом концентрация NO2 в слюне у таких пациентов значительно повышается при стимуляции лимонным соком, что указывает на регуляцию продукции NO2 слюнными железами за счет действия нервных импульсов [2]. Высокую заболеваемость злокачественными новообразованиями головы и шеи связывают с употреблением табака и жеванием бетеля [21]. Вероятно, компоненты табака выступают в качестве инициатора воспалительного ответа, что способствует продукции ROS/RNS и усилению ПОЛ, повышению продукции NO, нарушению антиоксидантной системы [22]. Компоненты табака, содержащие NO, вызывают нитрозилирующий стресс и повреждают молекулу ДНК. В свою очередь повреждение генов приводит к увеличению ROS/RNS, что предположительно является одним из механизмов развития рака при долговременном употреблении табака. Никотин также играет роль в развитии рака за счет NO- зависимого ингибирования апоптоза эпителиоцитов [23]. Повышение степени экспрессии NO, NO2, NO3 рассматривают в качестве биомаркеров оценки риска формирования карцином у лиц с предраковыми заболеваниями СОПР, употребляющих табак [22, 24]. Употребление алкоголя рассматривают в качестве фактора, повышающего предрасположенность к развитию карцином СОПР [25]. Метаболизм алкоголя связан с продукцией ROS и RNS. Этанол способствует продукции NO, что ускоряет апоптоз клеток нейтрофилами [26]. Установлено, что NO ингибирует NO/цГМФ-зависимый цитохром С, увеличивает экспрессию Bcl-2, контролирующий проницаемость мембран митохондрий, приводит к супрессии образовании церамида, активации циклооксигеназы-2 (COX-2) [27]. Показана связь между NO и индукцией апопто- за клеток при развитии плоскоклеточного рака головы и шеи [28]. Мутации гена р53 возможны за счет регулирования экспрессии iNOS и COX-2, что часто наблюдается при плоскоклеточном раке головы и шеи. iNOS-зависимое повреждение ДНК приводит к аккумуляциир53 при плоском лишае СОПР и карциномах головы и шеи [11, 29, 30]. Экспрессия iNOS изучена при подслизистом фиброзе СОПР, верруккозной лейкоплакии, карциноме [31]. Авторы предположили, что NOS-зависимые механизмы вовлечены в злокачественную трансформацию предраковых участков эпителия СОПР. Установлено, что экспрессия iNOS имеет прямую зависимость с тяжестью дисплазии [11]. Показано значительное повышение экспрессии iNOS, NO или его продуктов в плазме крови и слюне при карциномах головы и шеи [32]. Увеличение концентрации NOS напрямую зависит от стадии рака при опухолях головы и шеи. Степень экспрессии iNOS коррелирует со стадией развития опухоли при раке головы и шеи [7, 8]. In vitro показано, что увеличение экспрессии NO не вызывает повреждение фибробластов, кератиноцитов, эпителиальных клеток СОПР, и, как следствие, экспрессия NO в слюне связана с длительным течением воспаления СОПР [2]. NO участвует в формировании неоплазии, повреждении ДНК клетки за счет прямого действия или при ингибировании репарации ДНК. RNS - посредник между повреждением и формированием мутаций [7]. Данные о влиянии NO на активность каспаз противоречивы. С одной стороны, NO ингибирует активность каспаз и стимулирует синтез белков теплового шока, оказывая антиапоптотическое действие [7], с другой - участвует в реакциях S-нитрозилирования каспаз, активирует их и инициирует апоптоз клеток [33]. Большой интерес представляет роль NO в росте и мета- стазировании солидной опухоли, где NO оказывает одновременно ингибирование и активацию роста опухоли. Повышенная экспрессия NOS обнаружена при различной локализации онкологии, в том числе рака головы и шеи. Исследования показали повышенную регуляцию NOS при плоскоклеточном раке головы и шеи, что связывают с канцерогенезом СОПР [7] . Предполагается, что NO модулирует различные события, связанные с раком, включая ангиогенез, апоптоз, клеточный цикл, инвазию и метастазирование клеток опухоли [34]. Показано взаимодействие NO с матриксными метал- лопротеиназами (ММР). NO стимулирует инвазию клеток опухоли за счет стимуляции активности ММР-2, ММР-9, Review подавления ингибитора матриксной металлопротеиназы-2 (TIMP-2) и, возможно, TIMP-3 [7]. NO играет важную роль в метилировании ДНК и модификацию гистонов. Одна из важнейших функций NO в формировании опухоли - регуляция ангиогенеза. eNOS эндотелио- цитов сосудов опухоли способствует притоку крови за счет дилатации артериол, уменьшения взаимоотношения лейкоцитов и эндотелия, увеличения сосудистой проницаемости [8] . Повышение проницаемости эндотелия сосудов регулируется продукцией VEGF и синтезом NO. Также NO инициирует ангиогенез при активации COX-2, которая стимулирует продукцию проангиогенного фактора и простагландинов. В итоге усиливается рост опухоли за счет увеличения сосудистой проницаемости и ингибирования апоптоза при повышенной продукции Bcl-2 [8]. Установлена прямая зависимость между концентрацией NO и цитотоксичностью клеток опухоли in vitro при карциномах головы и шеи, при которых происходит существенное изменение свободнорадикального состава слюны [7]. Высокая степень экспрессии NO в слюне обнаружена при наличии язвенно-пролиферативных очагов карцином головы и шеи. У таких пациентов также выявлено глубокое окисление ДНК и белков слюны, усиленное образование RNS, снижение активности антиоксидантной системы [17]. Заключение В заключение необходимо отметить, что многообразие эффектов NO и его активных метаболитов определяет перспективу их изучения в качестве потенциального диагностического критерия оценки предраковых и онкологических заболеваний челюстно-лицевой области. Изучение метаболитов NO в ротовой жидкости может быть использовано для мониторинга активности предраковых заболеваний СОПР на всех этапах проводимого курса лечения и после него. Неинвазивность, высокая информативность, относительная доступность данного метода определяют необходимость дальнейшего изучения роли NO в качестве скринингового метода диагностики предраковых заболеваний, оценки риска трансформации в cancer in situ, повышения эффективности лечения и мониторинга состояния пациентов до и после лечения, составления прогноза течения заболевания. Конфликт интересов

About the authors

O. D Baydik

”Siberian state medical University”

Email: olgabajdik@yandex.ru
Dr. Sci. Med., Associate professor of the Department of Dentistry, “Siberian State Medical University” 634050, Tomsk

M. A Titarenko

”Siberian state medical University”

634050, Tomsk

P. G Sysolyatin

”Novosibirsk state medical University”

630091, Novosibirsk

References

Supplementary files