ELOPMENT OF A METHOD OF VOLUME-ACTIVATED PHOTODYNAMIC THERAPY OF DISEASES AND MICROBIAL AND NEOPLASTIC PROCESSES ON THE BASIS OF THE USE OF FLUORESCENT TECHNOLOGY

Full Text

Введение. Метод фотодинамической терапии (ФДТ) основан на способности фотосенсибилизатора (ФС) селективно (избирательно) накапливаться в злокачественных, патологически измененных или пораженных вирусами клетках и/или микробах [1-5]. После введения ФС следующим этапом процедуры является использование источника лазерного излучения для проведения облучения ткани, подверженной патологическому изменению. Свет определенной длины волны приводит ФС в возбужденное состояние с образованием в облучаемом биологическом объекте активных форм кислорода, что в свою очередь вызывает повреждение и некроз тканей, наиболее интенсивно накопивших данный препарат [6]. Таким образом, подвергаются некрозу (удаляются) только клетки, которые были изменены (очаги дисплазии, опухоль и т. д.), а здоровые клетки не реагируют на излучение (так как подбирается такая мощность и доза облучения, которые не повреждают здоровые клетки тканей). Эффект лечения (воздействия) существенно зависит от доступности облучаемого объекта для лазерного воздействия, глубины его эффективного проникновения в патологический очаг, концентрации ФС в нем и объемной плотности мощности излучения лазера [6-9]. В большинстве клинических приложений эффект лечения вследствие, например, малой глубины проникновения лазерного излучения в ткани бывает недостаточным, что приводит к рецидивам заболевания и угрожающим жизни осложнениям. Это относится и к очагам воспаления. Еще более ухудшает ситуацию невозможность анатомо-топографического обнаружения объекта, что полностью исключает эффект лечения [10]. Цель исследования. Мы поставили перед собой задачу разработать метод ФДТ, при котором ФС можно активировать вне объекта и при этом, поступая в биологический объект, он должен проникать и накапливаться в ткани, и там запускать процесс ФДТ во всем объеме накопившей препарат ткани (патологический объект микробной или неопластической природы). Материал и методы Исходя из представленной концепции, в качестве модельного объекта использовали культуру микробов (три вида - линейные штаммы стафилококка, стрептококка и устойчивого к современным антибиотикам клинического штамма сине-гнойной палочки) - 20 тест-образцов (из них 5 - контрольная группа) и культуру карциномы Эрлиха (45 тест-образцов и 15 - контрольная группа). В качестве объектов исследования использовали лабораторных мышей, которым внутрибрюшинно вводили 0,1 мл культурального материала. Пробоподготовка ФС (хлорофиллсодержащий препарат включает магнийпорфирин, аналогичный по составу железопорфирину гемоглобина) проходила несколько этапов. А. Подбор ФС с наибольшим квантовым выходом люминесценции при его резонансном облучении (этот этап включает подбор зондирующего лазерного излучения). Б. Подбор оптимальных параметров дозы облучения при диагностике и лечении заболеваний (этот этап включает подбор таких параметров излучения и регистрации сигнала, которые не искажают сигнал за время записи и не повреждают здоровые клетки). На рис. 1 показано несколько форм радахлорофилла с разной степенью очистки препарата (препарат 1, 3, 4, 5, 6 см. на вклейке). Эти препараты имеют относительно слабую люминесценцию и поэтому не подошли для диагностики и лечения, так как их накопление невелико в тканях и их сигнал люминесценции затруднительно диагностировать и эффективно возбудить для ФДТ, т. е. для выбора предпочтительного препарата необходимо предварительно проводить исследование его флюоресцентных характеристик, оптимально соответствующих ФДТ-технологии. На рис. 2 показаны спектры люминесценции препарата РХ (препарат 2 и 7), которые обладают наибольшим квантовым выходом, необходимым и достаточным для указанного метода лечения неопластических и воспалительных процессов. Для диагностики указанных хлорофиллсодержащих препаратов и контроля их поступления в ткани предварительно были выбраны оптимальные параметры времени и мощности излучения лазера для каждой длины волны, при которых не наблюдается эффект выгорания (рис. 3-5 см. на вклейке). В. Изучены все схемы возбуждения препарата, основываясь на спектре поглощения; показано, что наиболее эффективными длинами волн для возбуждения являются волны 405 нм и 637 нм (рис. 6 см. на вклейке). Г. Далее проверили суждение о том, что влияние кислорода без присутствия лазерного облучения (продувание кислорода через препарат Радахлорофилл 1 - 10 мин) не приводит к изменению интенсивности люминесцентного свечения препарата РХ, т. е. не вызывает (не активирует) ФДТ-реакцию (рис. 7). Д. Активация препарата лазерным излучением. «Радахлорин®» (РХ) обладает способностью поглощать свет в видимой области, результатом чего является его фотоактивация, а далее наблюдаются 2 эффекта. 1. Классическая ФДТ - релаксация возбужденного состояния РХ с переносом энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и далее на углерод органических субстратов. 2. Последнее приводит к окислительным процессам в биологических тканях, их повреждению и последующему разрушению (некрозу). «Радахлорин®» способен разрушать биологические субстраты после возбуждения светом с длиной волны 350-670 нм. Наиболее предпочтительной для ФДТ полосой возбуждения является самая длинноволновая полоса поглощения РХ (662 нм), так как с ростом длины волны растет проникающая способность света в биологические ткани (до 7 мм). Сохраняющаяся при этом способность препарата флюоресцировать оставляет возможность для люминесцентной диагностики очагов микробосодержащего и/или неопластического изменения тканей. Для этого препарат возбуждают в любую из полос - 406, 506, 536, 608 или 662 нм и регистрируют максимальную интенсивность флюоресценции при 668 нм, отмечая границы патологического очага. Результаты исследования 1. Моделирование объемной ФДТ в пробирке. Известно, что для образования синглетного кислорода (1О2) необходимо наличие молекул ФС, при помощи которых происходит передача энергии фотонов молекулам кислорода. Известно также, что эффективными ФС образования 1О2 являются основные пигменты фотосинтеза, например, производные хлорофиллов. Синглетным кислородом (1О2) называют электронно-возбужденные молекулы О2, находящиеся на одном из двух синглетных уровней - lg+ и lg. Таким образом, 1О2 отличается от других активных форм кислорода (радикалов О2-, НОО, ОН или перекиси водорода Н2О2) тем, что для его получения требуется лишь поглощение энергии без химической модификации кислородных молекул. Так, р-электронные молекулярные орбитали ядра порфина (18-π-электронная ароматическая система) стабилизируют супероксид-анионы, образующиеся в результате действия на ФС волновой энергии, приводя к химической устойчивости активированной формы ФС в течение, по крайней мере, нескольких дней. Перекиси, образующиеся под воздействием света и кислорода из упомянутых выше групп, присоединенных непосредственно к ароматической системе производных хлорофилла, стабилизированные наличием порфинового макроцикла и потому долго живущие, после введения в организм человека накапливаются по свойству, присущему производным хлорина е6, в очагах опухолевого, инфекционного, паразитарного, дерматологического, иммунологического или аллергического заболеваний, могут переносить атом кислорода, гидроксил-радикал либо электрон как друг на друга, так и на биомолекулы оболочек патологически измененных клеток или микроорганизмов. Представленные данные теоретически обосновывают предложенную нами инновационную концепцию ФДТ. На основе представленного изучены свойства активации в зависимости от длины волны лазерного излучения, параметров дозы облучения и метода доставки кислорода; определены оптимальные параметры облучения для получения наибольшего амплитудного контраста между облученным и необлученным образцами; исследована временная кинетическая зависимость эффекта восстановления люминесценции активированного препарата при отсутствии зондирующего (активирующего реакцию) его облучения и установлено время восстановления люминесценции при различных вариантах доставки кислорода (перекись, кислород, озон) (рис. 8, 9 см. на вклейке). Таким образом, восстановление амплитудно-спект-ральных характеристик (с высвобождением активных форм кислорода) активированного препарата Радохлорофилла (РХ) происходит без лазерного облучения. Установлено, что выгорание люминесценции РХ при поглощении 1 Дж составляет 5%, при поглощении 3 Дж - 18%, при поглощении 10 Дж - 25%; увеличении дозы более 30 Дж не увеличивает активность и интенсивность ответной реакции. 2. Изучение эффекта накопления активированного и неактивированного препарата РХ в органы и ткани мыши. В эксперименте показана реальная возможность активации хлорофиллсодержащего ФС вне БО и его накопление в органах и тканях (рис. 10). Это позволило впервые разработать методику объемной активированной ФДТ микрофлоры. 3. Методика объемной активированной ФДТ (ин витро). Для проведения эксперимента взяты два микроорганизма - Ps. aeruginosa и S. aureus. В качестве основы для эксперимента использовали диско-диффузионный метод, основанный на диффузии антибиотиков из носителя в плотную питательную среду и ингибиции роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит минимальную подавляющую концентрацию. Для эксперимента использовали сертифицированный аппаратно-программный комплекс «Ин Спектр М» (рис. 11) и метод лазерной флюоресцентной диагностики [10, 11]. Из чистой суточной культуры Ps. aeruginosa и S. aureus, выращенной на неселективной плотной питательной среде, с помощью дистиллированной воды готовили инокулят 0,5 по Мак Фарланду, что соответствует концентрации 1·108 КОЕ/мл. Полученный инокулят наносили на МХ-агар. Затем помещали диски, пропитанные Радохлорином, предварительно активированным кислородсодержащим препаратом и лазерным излучением с длиной волны 0,63, 0,514, 0,405 нм в дозе 0,2-20 Дж/мл, в концентрации 0,7%, 0,07%, 0,007%. В качестве контроля использовали стерильные диски, диски с неактивированным препаратом (в тех же концентрациях), диски с препаратом после воздействия на него кислородсодержащего водного раствора, диски с кислородсодержащим водным раствором (перекись водорода 3%). Через 24 ч проводили измерение зоны задержки роста микроорганизма. В таблице и на рис. 12-14 видно, что при активации Радохлорина «С» наблюдали подавление зоны роста микроорганизма через 24 ч, при этом неактивированный препарат с Ps. aeruginosa не давал задержки зоны роста, а у S. aureus отмечали небольшое подавление зоны роста. При добавлении к активированному хлорофиллсодержащему (Радохлорофилл «С») препарату кислородсодержащего водного раствора у Ps. aeruginosa также наблюдали увеличение задержки зоны роста. Показана высокая бактерицидная эффективность активированного вне бактериального субстрата (и после этого добавленного в него). Наибольшая зона задержки роста выявлена при концентрации препарата 0,7% + 3% Н2О2 и дозе лазерного облучения 20 Дж. Полученный эффект сравним с бактерицидным действием антибиотика цефепима как объекта сравнения (цефепим 30 мг - диск на 12 ч на всех чашках Петри). Интересный результат получен при использовании антибиотикоустойчивого клинического штамма (рис. 15 - внизу на 18 ч) и его выраженном бактерицидном эффекте при использовании активированного хлорофиллсодержащего препарата при различных концентрациях (0,7, 0,07 и 0,007%). В результате исследования можно полагать, что при добавлении кислородсодержащего препарата к Радохлорофиллу «С» и активации его лазерным излучением с длиной волны 0,63, 0,514, 0,405 нм в дозе 0,2-20 Дж/мл происходит взаимодействие возбужденного фотосенсибилизатора с молекулой кислорода, в результате чего образуется синглетный кислород, который является цитотоксическим для живых клеток из-за его свойств сильного окислителя биомолекул. Синглентный кислород также образуется в фагоцитах при реакциях дыхательного взрыва. Имеются доказательства высокой бактерицидной эффективности активных форм кислорода (синглентный кислород, радикал супероксида, перекись водорода, гидроксильный радикал) в отношении большинства микробов [6]. Можно предположить, что взаимодействие активированного «Радохлорофилла «С» с микробной клеткой схоже с кислородзависимой подсистемой микробоцидной системы фагоцитов, к которой нет привыкания. Таким образом, способность фотосенсибилизатора накапливаться в измененных тканях, микробных клетках с реализацией эффекта летальной фотосенсибилизации бактерий может быть использована при лечении антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов. 4. Апробация методики объемной активированной ФДТ при лечении опухолей (карцинома Эрлиха у мышей). В исследовании использовали 60 лабораторных мышей (из них 15 - контрольная группа). В опытной группе 15 мышей принимали неактивированный препарат в разведении 1:10, 15 - активированный препарат (активирован максимальной дозой лазерного облучения) в разведении 1:10, в следующей группе 15 мышей принимали аналогичный активированный препарат в разведении 1:1000. Дополнительно к группе с приемом препарата в качестве контроля использовали мышей, которые не принимали препарат - 7 мышей пили чистую воду (чистый контроль) и принимали раствор перекиси водорода 3%, разбавленный в 10 раз (донор кислорода, используемый для активации хлорофиллсодержащего препарата). Прием указанных препаратов осуществляли 2 мес. Через 2 мес всем мышам (кроме группы с чистым контролем) ввели внутрибрюшинно взвесь культуры клеток карциномы Эрлиха, объемом 0,1 мл (дополнительно культуру ввели еще 10 мышам, которые не принимали никаких препаратов и пили чистую воду - второй чистый контроль). В дальнейшем проводили динамическое ежедневное наблюдение. Установлено, что мыши в группе с чистым контролем были активны и живы в течение всего исследования (1 год). Мыши со вторым чистым контролем быстро увеличивались в размерах (асцит) и погибали на 4-6-й день. Мыши, принимавшие препарат, содержащий неактивированный хлорофилл или раствор 1:10 Н2О2 3%, погибали на 6-12-й день. Мыши, принимавшие активированный препарат в разведении 1:10, жили 21-24 дня, а при его разведении 1:1000 - погибали в пределах 10 дней. Таким образом, показан противоопухолевый эффект хлорофиллсодержащего препарата, активированного вне организма. Выявленный эффект существенным образом зависит от концентрации вводимого активированного препарата и дозы лазерной его активации (оптимизация эффекта лечения). В методологическом, методическом и прикладном плане авторами разработаны и предлагаются для внедрения в клиническую и лабораторную практику адекватные методы лечения заболеваний и процессов микробной и неопластической природы, основанные на принципиально новых принципах активированной объемной фотодинамической терапии [13, 14].

About the authors

Mikhail Timofeevich Aleksandrov

Scientific and Clinical Center for Women’s Health Rehabilitation

Email: alex_mta@mail.ru
Dr. med. Sci., Professor 101000, Moscow

E. P Pashkov

Scientific and Clinical Center for Women’s Health Rehabilitation

101000, Moscow

E. M Satusheva

Scientific and Clinical Center for Women’s Health Rehabilitation

101000, Moscow

G. E Bagramova

Scientific and Clinical Center for Women’s Health Rehabilitation

101000, Moscow

References

Supplementary files