Gender analysis of the microbiota of periodontal pockets in patients with chronical generalized periodontitis

Full Text

Введение Пародонтит - это хроническое воспалительное заболевание, представляющее собой разрушение зубодесневого прикрепления и альвеолярной кости, вызванное генетическими факторами и внешними местными воздействиями, такими как патология прикуса, мелкое преддверье полости рта, наличие тянущих уздечек верхней и нижней губы, характер питания, ношение ортодонтических или ортопедических конструкций и др. Главной этиологической причиной этого заболевания является микробная инфекция [5]. Однако до сих пор остается неизвестным молекулярный механизм распада пародонтальной связки [4], а именно непонятна роль протеолитической активности бактериальных ферментов и человеческой матричной металлопротеиназы (ММП) [11]. Этот параметр ранее уже рассматривался в некоторых исследованиях, однако никто не говорил о различии течения хронического пародонтита у мужчин и женщин [3]. Можно предположить, что они не видны из-за полиэтиологической природы данного заболевания. В рамках данного исследования мы использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для количественного и качественного анализа основных па- родонтопатогенов: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porhyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tanerella forsythensis и Treponema denticola, а также уровень представленности мРНК TNFa, MMP8 и MMP9 в содержимом пародон- тальных карманов. В выборку входили пациенты с легкой, средней и тяжелой степенью хронического генерализованного пародонтита (ХГП), а также лица со здоровым пародонтом. Хорошо освещенно в литературе утверждение о том, что повышенная концентрация TNFa, ММР8 и ММР9 связана с обострением хронического пародонтита [1]. Авторы предполагают, что за поражение тканей пародонта отвечает реакция Т-хелперов 1-го типа, в которой участвует TNFa, а реакция Т-хелперов 2-го типа, в число которых входят MMP8 и MMP9, считается принципиальным антибактериальным защитным механизмом. Целью нашей работы явилось нахождение статистически значимой связи между состоянием пародонта у мужчин и женщин с уровнем представленности мРНК TNFa, ММР8, ММР9 и со степенью обсемененности тканей пародонта наиболее значимыми пародонтопатогенами, используя как параметрические, так и непараметрические методы. Материал и методы В исследовании принимали участие лица обоего пола в возрасте от 21 года до 63 лет с ХГП различной степени тяжести (n = 204) и практически здоровые лица без видимых клинических изменений тканей пародонта (n = 84). Пациентами подписано информированное согласие, в котором описывались все условия их участия в исследовании. Клиническое обследование начинали со сбора жалоб и анамнеза пациентов, внешнего осмотра, определения глубины пародонтальных карманов, гигиенических индексов. При сборе анамнеза особое внимание уделяли наличию или отсутствию наследственной отягощенности по заболеваниям па- родонта со стороны отца и матери. Выясняли наличие сопутствующей соматической патологии, оказывающей влияние на состояние тканей пародонта, а также вредных привычек, таких как курение, а также уровень гигиенических навыков. При внешнем осмотре пациентов оценивали конфигурацию лица, пропорциональность верхней, средней, нижней трети лица, выраженность носогубных и подбородочных складок. Осмотр полости рта начинали с определения состояния слизистой оболочки, фенотипа десны, глубины преддверия и прикрепления уздечек верхней и нижней губы. Определяли количество зубов, наличие пломб, шинирующих и ортопедических конструкций. В качестве дополнительного метода использовали цифровые ортопантомограммы. Содержимое пародонтальных карманов извлекали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов и помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл, содержащих по 0,5 мл раствора для гомогенизации образцов из набора Проба-Рапид (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Далее образцы именуются «пародонтальный смыв». Для выявления ДНК инфекционных агентов и оценки количества геномной ДНК пациента (в качестве нормировочного показателя) экстракцию ДНК из биологического материала проводили с помощью комплектов для экстракции ДНК «Проба-ГС» и «Проба-Рапид» (ООО «НПО ДНК- Технология», Россия) согласно инструкциям производителя. Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Statistica 8,0 для Windows по стандартным методикам вариационной статистики. При нормальном распределении величин в выборках сравнивали значения Сопоставление уровня представленности молекулярных маркеров в смывах паро- донта в группе контроля и группе пациентов с ХГП без разделения по полам. /-критерия Стьюдента и F-критерия Фишера. Результаты С помощью коэффициента Спирмена выявлена связь между гиперколонизацией пародонта P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denti- cola у всех пациентов независимо от состояния пародонта, что четко видно на рис. 1. Внутри многоугольников указаны коэффициенты корреляции Спирмена между параметрами в пределах групп. На врезке между многоугольниками указаны коэффициенты Манна-Уитни, характеризующие достоверность различий между группами по указанным параметрам. Статистический анализ с применением метода вычисления коэффициента корреляции по Спирмену показал, что четыре из пяти пародонтопатогенов по Сокранскому: P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola показывает выраженную склонность к коинфекции (см. рис. 1.). Корреляция в наблюдаемой одновременной колонизации пародонта P. gingivalis/P. intermedia характеризуется коэффицинетом R = 2,6 (p = 8,5^10-3), P. gingivalis/T. forsythensis - R = 2,6 (p = 1,Г10-2), а P. gingivalis/T. denticola - R = 3,4 (p = 1,1*10-3). Прочность комплекса P. intermedia/T. denticola характеризуется величиной R = 4,0 (p = 3,5^10-3). Комплекс T. forsythensis/ T. denticola наиболее стабилен, показывая R = 6,5 (p = 1,0-10-8). При анализе генеральной совокупности всех пациентов наблюдается также корреляция между представленностью транскриптов TNFa/MMP8: R = 3,7 (p = 6,6-Ш-4) и TNFa/MMP9: R = 3,7 (p = 6,5^104). При анализе представленности маркеров в выборках случай/контроль и мужчины/женщины методом непараметрического сравнения по Манну-Уитни установлено, что уровень траскрипов IL8, TNFa, MMP8 и MMP9 во всех четырех выборках в среднем одинаков. Однако с помощью анализа по Спирмену установлено, что внутри выборки контроля наблюдается существенно более достоверная корреляция в поведении пар маркеров TNFa-MMP8 и TNFa-MMP9, чем в генеральной совокупности всех пациентов. Более того, в контрольной выборке найдена корреляция между маркерами MMP8 и MMP9 (R = 5,3 при p = 1,8-10-4), которую не наблюдали в генеральной совокупности. Это наблюдение позволяет сделать вывод о том, что скоординированное изменение уровня продукции TNFa, MMP8 и MMP9 является составной частью механизма эффективной защиты пародонта от патогенов в норме. Разрушение этого механизма, приводящее к хаотической передаче сигналов, является атрибутом патологического состояния пародонта. Также обнаружено, что содержание мРНК TNFa проявляет небольшую отрицательную корреляцию со степенью колонизации пародонта T. denticola R = 2,3 (p = 4,Г10-2) в контрольной выборке в отличие от группы пациентов с ХГП. Установлено отсутствие склонности пациентов без ХГП к множественной инфекции пародонтопатогенами. Использование корреляционного анализа по Спирмену показало, что корреляция в уровне экспрессии MMP8 и TNFa у больных ХГП характеризуется R = 2,0 (p = 5,5^10-2), т. е. она в несколько раз менее жесткая, чем в выборке контроля. Корреляция в экспрессии пары TNFa/MMP9 в выборке пациентов с ХГП полностью утрачена. Корреляция в экспрессии MMP8 и MMP9 меняет знак на отрицательный: R = 2,4 (p = 2,Г10-2). В выборке женщин без разделения на больных ХГП и контроль корреляция в уровне представленности маркеров мРНК TNFa-MMP8-MMP9 существенно ниже, чем в генеральной совокупности. мРНК TNFa и MMP9 экспрессируются независимо. Корреляция в экспрессии TNFa и MMP8 формально выявляется, но находится на пределе достоверности. В отличие от выборки женщин в выборке мужчин без разделения на ХГП и контроль наблюдается жесткая корреляция в экспрессии мРНК TNFa/MMP8 (R = 3,7 (p = 1,1'10-3)) и TNFa/MMP9 (R = 2,7 (p = 1,3-10-2)). Сравнение выборок ХГП и контроля с применением непараметрического критерия Манна-Уитни показывает существенное отличие в степени колонизации их пародонта P. gingivalis (p = 1,2^10-5), P. intermedia (p = 3,4^10-3), T. forsythensis (p = 6,Г10-4) и T. denticola (p = 7,8^10-4). Оригинальная статья Аналогичные результаты наблюдаются при разделении на подвыборки больных ХГП и контроля внутри группы женщин. При этом наблюдаются значимые различия по степени колонизации пародонта патогенами P. gingivalis (p = 1,2N0-4), P. intermedia (p = 1,6N0-2), T. forsythensis (p = 1,9^10-3) и T. denticola (p = 5,T10-4). Некоторое снижение коэффициентов Фишера в выборке женщин по сравнению с генеральной совокупностью полностью объясняется сокращением размера выборки. Напротив, при разбиении группы мужчин на пациентов с ХГП и контроль и сопоставлении полученных подгрупп с помощью критерия Манна-Уитни наблюдается практически полная утрата достоверности отличий. Единственным патогеном, проявляющим небольшое отличие в степени колонизации мужчин с ХГП и группы контроля, является T. forsythensis (p = 3,7N0-2). Заключение Полученные данные позволяют предложить количественные критерии количественной оценки состояния пародон- та. Эти методы позволяют проводить раннюю диагностику предрасположенности к пародонтиту на стадии, когда консорциум с участием пародонтопатогенов уже сложился, но деградация пародонта еще не началась. Эти тесты могут также играть роль при оценке эффективности лечения, что позволяет сократить время на подбор препарата для индивидуального больного, а также при первичной оценке эффективности новых препаратов и методов лечения. Принимая во внимание эти соображения, выявленный факт скоординированной экспрессии TNFa с MMP8 и MMP9 может иметь существенное практическое значение. Полученные данные опровергают устоявшееся в литературе мнение о защитной неэффективности и даже вредоносности острого неспецифического ответа типа Th1 на пародонтопатогены (в отличие от ответа типа Th2, приводящего к выработке антител). По-видимому, в случае быстрого развития Th 1-ответ, включающий в качестве сигнальных факторов TNFa, MMP8 и MMP9, способен эффективно блокировать проникновение во внутреннюю среду организма пародонтопатогенов прежде всего P. gingivalis. И лишь в случае запаздывания с последующим переходом в хроническую стадию эффективность Th 1-ответа утрачивается. Описанный механизм, по-видимому, эффективно срабатывает у многих мужчин, но не у женщин. Наиболее вероятно, что именно с этим связано преобладание P. gingivalis в качестве этиологического агента ХГП у женщин при высокой устойчивости к нему мужчин. При сравнении выборок контроля и ХГП внутри группы мужчин с применением критерия Манна-Уитни установлено, что T. forsythensis является патогеном, примерно в равной мере опасным как для мужчин, так и для женщин. При сравнении подвыборок здоровых мужчин и мужчин с ХГП по Манну-Уитни достоверность различия невысока: она характеризуется коэффициентом R = 3,7'10-2. Однако для мужчин в отличие от женщин характерно формирование комплекса T. forsythensis/T. denticola, который представляет собой наибольшую угрозу для пародонта особенно в пожилом возрасте.

About the authors

Oksana Aleksandrovna Zorina

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery of Ministry of Health of the Russian Federation

Email: zorina-cniis@yandex.ru
doctor of medicine, professor, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery of Ministry of Health of the Russian Federation 119991, Moscow

N. K Aymadinova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

119991, Moscow

D. V Rebrikov

N.I. Vavilov Institute of General Genetics

Moscow

References

Supplementary files