DISTURBANCE OF IRON METABOLISM AND ULTRASTRUCTURAL FEATURES OF THE GINGIVA IN PATIENTS WITH Β-THALASSEMIA MAJOR

Full Text

Талассемия - наследственное заболевание, развивающееся в результате нарушения синтеза гемоглобиновых цепей. Большая (гомозиготная) β-талассемия является одним из наиболее тяжёлых видов гемолитических анемий, взаимосвязанных с дефектом гена, ответственного за синтез β-цепей гемоглобина и имеет тяжёлое прогрессирующее течение. Основным методом лечения больных гомозиготной формой β-талассемии является регулярное переливание крови, что приводит к избыточному накоплению железа в крови и в ряде внутренних органов. Железо при избыточном содержании катализирует окислительный процесс за счёт перекисного окисления липидов тиоловых соединений, в том числе белков, инициируя повреждение ДНК [1-5]. Следует учитывать и тот факт, что избыточное железо увеличивает активность патогенных микроорганизмов и может стать причиной развития локальных и системных воспалительных процессов [5-7]. Метаболические нарушения, возникающие в условиях перегрузки организма железом, формируют дополнительный риск повреждения и клеточной модификации органов и тканей, их инфицирования и хронизации воспалительных процессов, в том числе и в полости рта [6-9]. Между тем этиология и патогенез воспалительно-дегенеративных дистрофических изменений в околозубных тканях, нередко распространённых среди пациентов с β-талассемией, до сих пор не рассматривается с позиции особых факторов и механизмов тканевого повреждения при наследственной гемоглобинопатии, к числу которых относится выраженный метаболизм железа. Цель исследования - определение патогенетической роли нарушения обмена железа в развитии генерализованных воспалительных заболеваний пародонта (ГВЗП) у больных β-талассемией. Задачи исследования: определение параметров обмена железа с оценкой его особенностей у больных β-талассемией с ГВЗП; выявление особенностей цитокинового статуса у больных β-талассемией с ГВЗП в сопоставлении с показателями обмена железа; характеристика ультраструктурных параметров аккумуляции железа в тканевых элементах десны у больных гомозиготной формой β-талассемии при ГВЗП. Материал и методы Обследование проводилось в Республиканском центре талассемии (г. Баку), в клинике стоматологии и лаборатории гистологии Азербайджанского государственного университета. Для решения поставленных задач 12 пациентов с гомозиготной формой β-талассемии в возрасте от 14 до 26 лет (18,0 ± 1,3 года) c изменениями в пародонте были сформированы в основную группу. Контрольную группу составили 24 человека (средний возраст 18,1 ± 0,8 года) с интактным пародонтом, не имеющих соматическую патологию. Стоматологическое обследование пациентов осуществлялось в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 1990 г. Для объективной оценки состояния тканей пародонта использовали следующие клинические тесты: упрощённый индекс гигиены Грин-Вермиллиона OHI-S (Green J.C., Vermillion J.R., 1960); папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (РМА) (Parma C., 1960); индекс кровоточивости (ИК) (Muhlemann H.R., Cowell I., 1975) и коммунальный пародонтальный индекс - CPI. Для решения поставленных задач у наблюдающихся пациентов в контрольной (n = 16) и основной группе (n = 12) определяли также показатели сывороточного железа, ферритина, гепсидина, общую железосвязывающую способность крови и уровень цитокинов (TNF-α; IL-6; IL-2). Определение ферритина проводили с помощью наборов фирмы Pishtaz Teb diagnostik (Иран), определение гепсидина - с помощью тестов фирмы Cloud-Clone Corp (США). Показатели метаболизма железа в сыворотке крови выявляли колориметрическим методом с использованием в качестве хромогена NitroPAPS. Для определения уровня концентрации IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α в крови использовался метод твёрдофазного иммуноферментного анализа (ELİSA) с использованием набора реактивов Vector BEST (Российская Федерация). Результаты представлялись на cтриповом иммуноферментном анализаторе StatFax 303+ при длине волны 450 мм (дифференциальный фильтр 650 мм). Для определения ультраструктурных особенностей строения тканевых элементов десны использовали метод электронно-микроскопического исследования. Фрагменты десневой ткани размером 2 мм³ в области межзубного сосочка были взяты во время плановых удалений зубов, не подлежащих консервативному лечению или во время удаления зубных отложений под инфильтрационной анестезией (Ультракаином D). Обработка материала - фиксация, постфиксация, обезвоживание и заливка в аралдит-эпоновые блоки проводилась по общепринятой методике. Из данных блоков при помощи ультратома Leica EM UC7 были приготовлены последовательно срезанные окрашенные с помощью трихромного окрашивания по F. D’Amico (2005) и неокрашенные ультратонкие срезы толщиной 35-70 нм для исследования на трансмиссионном электронном микроскопе JEM 1400 (JEOL-Japan). Фотографирование и получение морфометрических показателей структурных элементов десны осуществляли с помощью боковой цифровой камеры Veleta и программного обеспечения iTEM. Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационного (средние данные) и дисперсионного (тест ANOVA) анализов с помощью компьютерных программ MS EXCEL-2013 и SPSS-20. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался при p < 0,05 (по Фишеру). Результаты и обсуждение На основе клинико-рентгенологических показателей у пациентов с большой β-талассемией диагностировались различные формы ГВЗП. При сравнении значений индекса РМА в двух группах, наибольшее значение было установлено у пациентов с большой β-талассемией (38,8 ± 1,5), что в 2,1 раза выше, чем в контрольной группе (p < 0,001). Аналогичная тенденция отмечалась и при оценке индекса кровоточивости. Исследование показателей интенсивности поражения пародонта в виде индекса CPI (секстанты) показало, что в контрольной группе интактные секстанты составили 4,46 ± 0,28, что не отмечено в основной группе здоровых. В группе пациентов с большой β-талассемией секстанты с кровоточивостью дёсен составили 2,25 ± 0,59, секстанты с зубным камнем - 2,92 ± 0,53; с патологическим зубодесневым карманом 4-5 мм - 0,58±0,26. Полученные данные значительно превышали значения аналогичных показателей в контрольной группе (р < 0,001). При оценке уровня гигиены полости рта в основной группе обследованных индекс гигиены Грин-Вермиллиона (OHI-S) составил в среднем 3,79 ± 0,33 балла, а в контрольной 1,59 ± 0,11 балла. Результаты исследований обмена железа в крови в обследуемых группах показали увеличение содержания сывороточного железа и ферритина на фоне прогрессивно снижающейся общей железосвязывающей способности крови у больных большой β-талассемией. Следует отметить, что все пациенты получали хелатную терапию десфералом (табл. 1). Также у гомозиготных больных отмечалось одновременное нарастание в крови уровня гепсидина - многофункционального регулятора обмена железа, участвующего в подавлении микробного фактора и в активации цитокиновых каскадов воспаления [9]. Полученным данным соответствовала выраженная активация провоспалительных цитокинов - Il-6, TNF-α и реактивного нарастания в крови уровня противовоспалительного фактора Il-2 у больных большой β-талассемией, что отличало их от лиц контрольной группы (см. табл. 1). Таким образом, результаты проведённого исследования подтвердили нарастающую с годами жизни перегрузку железом организма больных β-талассемией. Изучение ультраструктурных особенностей десневой ткани выявило признаки накопления железа в клеточных элементах как собственной пластинки, так и эпителиального покрова. Независимо от типов клеток, участвующих в формировании эпителиального покрова, в цитоплазме клеточных элементов свободной части десны у больных с большой β-талассемией наряду с отдельно расположенными молекулами ферритина встречаются их скопления, вокруг которых обнаруживаются различные формы структурных изменений цитоплазматических элементов (рис. 1). - вокруг ферритиновых скоплений часто выявлялись электронно-светлые участки различного размера, лишенные каких-либо структурных элементов (рис. 1, а, б и в); - за счёт высокой осмиофильности в местах описанных скоплений цитоплазматический матрикс отличался выраженной электронной плотностью (рис. 1, е): - внутри скоплений (см. рис.1, в) или вокруг (рис.1, д) обнаруживались деструктурированные части цитоплазмы, окруженные мембранными элементами (показано стрелками): - часто вокруг ферритиновых скоплений выявлялось большое количество эндоплазматического ретикулума с расширенными цистернами (рис. 1, б, г, е): - за счёт разрушения белковой оболочки и слияния железистых сердцевин наблюдались очаги формирования депротеинизированной и денатурированной форм ферритина - гемосидерина, не окруженного мембранными структурами см. рис. 1, в, г). В большинстве клеточных типов собственной пластинки и эпителиального покрытия десны у больных с большой β-талассемией установлено неравномерное распределение (анизотропия) молекул ферритина, т.е. обычно их количество в цитоплазме намного больше, чем в составе нуклеоплазмы [10]. При этом следует подчеркнуть, что описанная анизотропия резко нарушается в распределении молекул ферритина, подвергшихся депротеинизации. В качества примера продемонстрировано распределение структурных элементом молекул ферритина у моноцита (рис. 2, а, б) и лимфоцита (рис. 2, в, г). Обозначение: ЦП - цитоплазма; ЛТ-лимфоцит; НП - нуклеоплазма. Электронограммы неокрашенных ультратонких срезов рис.2, б, г являются увеличенными фрагментами соответственно рис.2, а, в с начальным увеличением - х 100 000. В центре рис 2, а показан моноцит, формирующий схожие с иммунологическими синапсы [11, 12], плотные контакты с макрофагом (справа) и отростками фибробластов (влево и сверху), окруженными пучками коллагеновых волокон. Ферритиновые скопления отмечены как в цитоплазме, так и в нуклеоплазме моноцита (часть из них показана на рис.2, а стрелками). Следует подчеркнуть, что при малом увеличении электронного микроскопа в цитоплазме описанной клетки кроме ферритиновых скоплений и отдельных вакуолей почти невозможно определить место расположения каких-либо органелл. На рис. 2, в показан увеличенный фрагмент моноцита (рис. 2, а, выделен рамкой), где виден фрагмент ядра (в левой стороне) и окружающая его часть цитоплазмы (в правой стороне). В периферических частях ядра обнаруживаются многочисленные железистые сердцевины молекул ферритина в виде полосы. По сравнению с ними, меньшее их количество обнаруживается как в оставшейся части ядра, так и в цитоплазме моноцита. Между указанными частями моноцита видна электронно-светлая полоса, соответствующая месту расположения ядерной оболочки (показаны кончиками стрелок) в которой даже нет следа характерных мембранных структур. На рис.2, а продемонстрирован лимфоцит меньше обычного по диаметру (менее 4 мкм), расположенный в расширенном межклеточном пространстве кератиноцитов супрабазального слоя десны. Значительную часть поперечного сечения лимфоцита занимает ядро с тремя расширенными перинуклеарными цистернами (показаны стрелками), вокруг которых не обнаруживаются характерные мембранные структуры. За счёт наличия многочисленных электронно-плотных частиц нарушены структуры, характерные для ядрышка, а также для гетеро- и эухроматина. Как обычно, ядро лимфоцита со всех сторон окружено узким ободком цитоплазмы, в составе которой лишь мелкозернистые электронно-плотные частицы и аморфный цитозоль, а органеллы и элементы цитоскелета не обнаруживаются. Кроме указанных деструктивных изменений за счёт отсутствия мембранных структур установить границу между цитозолем и нуклеоплазмой (показаны кончиками стрелок) становится невозможным. Необходимо подчеркнуть, что подавляющее большинство электронно-плотных частиц, расположенных в составе продемонстрированных клеток, не имеют белковую оболочку. Таким образом, подытоживая полученные данные, можно заключить, что депротеинизация ферритиновых сердцевин и обнаружения их как в цитоплазме, так и в нуклеоплазме иммунокомпотетных клеток приводит к необратимым дегенеративным изменениям клеточных элементов десны, среди которых, преобладающими являются макрофаги, моноциты и лимфоциты. В этой связи можно предположить, что структурные изменения источников формирования иммуннокомпетентных клеток сопровождаются нарушениями иммунных ответов, при которых воспалительные процессы носят хронический характер и приводят к формированию склеротических изменений десны у больных с большой β-талассемией. Биохимическими субстратами патогенеза стоматологической патологии является перегрузка тканей пародонта и иммунокомпетентных клеток отложениями железа. Выводы на основе поведённого исследования: 1. У больных большой β-талассемией отмечается перегрузка организма железом, что сопровождается и увеличением содержания гепсидина в крови. 2. Больных большой β-талассемией отличает более высокая заболеваемость ГВЗП. 2. Изменения обмена железа у гомозиготных больных β-талассемией сопряжены с активацией цитокиновых каскадов воспаления. 3. Перегрузка тканей пародонта и иммунокомпетентных клеток отложениями железа, влечёт клеточно - тканевую модификацию на ультраструктурном уровне, вызывает инициацию и хронизацию местного воспалительного процесса с дегенеративным компонентом.

About the authors

Ramida Vaqif qizi Shadlinskaya

Department of pediatric dentistry of Azerbaijan medical University, Dental clinic AMU

Email: ramidas@mail.ru
PhD, associate professor Department of Child Dentistry of Azerbaijan Medical University Ministry of Health of Azerbaijan Republic AZ1078, Baku, Azerbaijan

E. K Gasimov

Department of histology, embryology and Cytology of Azerbaijan medical University

AZ1078, Baku

S. A Israfilova

Department of histology, embryology and Cytology of Azerbaijan medical University

AZ1078, Baku

References

Supplementary files