Latent herpes virus infection in the carcinogenesis of bladder cancer

Full Text

В настоящее время в литературе обсуждается вопрос об этиологической роли инфекционных агентов, в частности вирусов, в генезе развития опухолей мочевого пузыря, их влиянии на частоту рецидивирования и развития инвазивных и метастатических его форм. Вирус Эпштейна-Барр (EBV) является представителем онкогенных ДНК-содержащих вирусов, и диапазон онкологических заболеваний, ассоциированных с ним, постоянно увеличивается: доказано участие EBV в развитии лимфомы Беркитта, назофарингеальной карциномы, волосатой лейкоплакии, рака желудка [1, 2]. В литературе есть указания на выявление лимфоцитов, содержащих EBV, у пациентов с более высокими стадиями опухолевого процесса мочевого пузыря [3, 4]. Онкомодулирующий эффект цитомегаловируса (CMV) при глиобластомах, опухолях кишечника считается доказанным. Для оказания такого эффекта необходима длительная персистенция вируса в организме. При этом CMV не способен инициировать подобные изменения в неопухолевых клетках [5]. A.Evans и N.Mueller разработали критерии, в которых указаны признаки, которыми должны обладать вирусы для индукции опухолевого процесса [6]: • необходимость длительного инкубационного или индукционного периода (периода латентности) между первичной инфекцией и развитием онкологического процесса; • чаще всего субклиническое течение первичной вирусной инфекции; • необходимость наличия кофакторов индукции онкогенеза; • высокий уровень вирусных антител, превышающий таковой у здоровых людей; • авторы уделяют особое внимание состоянию организма человека как предрасполагающего фактора для развития рака (возраст инфицирования, генетическая предрасположенность, состояние иммунной системы и т.д.); • определенное географическое распространение вируса; • эффективность вакцинации - снижение заболеваемости раком. Исследователи утверждают, что онкогенные вирусы могут играть разную роль на определенных этапах онкогенеза: альтерация иммунной системы, онкогены, хромосомные транслокации и т.д. [7]. Семейство герпес-вирусов (Herpesviridae: греч. herpes - ползучий) объединяет пантропность к органам и тканям, пожизненную персистентность и способность вызывать многообразные манифестные формы заболевания. Семейство насчитывает около 100 вирусов, 8 из которых вызывают заболевания у человека. Вирус простого герпеса (HSV-1) относится к a-герпес-вирусам и является вирусом 1-го типа, генитальный герпес относится к a-герпес-вирусам 2-го типа, CMV человека является вирусом 5-го типа (b-герпес-вирус), вирус Эпштейна-Барр относится к g-герпес-вирусам. Все эти вирусы длительное время могут персистировать в организме человека [8]. Герпес-вирусы широко распространены в человеческой популяции, они способны поражать практически все органы и системы организма хозяина, вызывая латентную, острую, хроническую и медленную формы инфекции. Эти факты позволяют рассматривать герпес как общее системное заболевание организма. Считают, что на территории России и СНГ различными формами герпес-вирусной ифекции ежегодно страдают около 20 млн человек [8]. Латентное состояние вирусов герпеса характеризуется практически полным отсутствием репликации вирусных генов и синтеза белков, выделения вирионов, а также персистенцией и обратимостью [9]. При этом вирусный геном обнаруживается в ядре и цитоплазме в виде эписом (неинтегрирован в геном клетки, ассоциирован с нуклеосомами), как показано для большинства герпес-вирусов человека, так и в интегрированном в хромосомы виде (EBV, вирус герпеса человека 6-го типа). Механизмы, приводящие к реактивации транскрипции вирусного генома, изучены недостаточно полно. Находясь в состоянии латентности, вирус практически «уходит» из-под иммунного надзора. Поэтому состояние латентности является ключевым событием в формировании персистентных герпес-вирусных заболеваний. В частности, реактивация латентной инфекции EBV может сопровождаться развитием хронической активной EBV-инфекции, при которой происходит внедрение EBV в Т-лимфоциты и NK-клетки. Клинически это может проявляться рецидивирующими мононуклеозо-подобными симптомами. Лабораторные тесты выявляют высокие титры противовирусных антител (анти-VCA, анти-EBNA), вирусную ДНК в большом количестве. Прогрессирование процесса ведет к быстрой смерти больных от тяжелых инфекционных процессов и кровотечений в результате развития гемофагоцитарного синдрома. Причинами летальных исходов могут стать фульминантный гепатит, осложнения гемоваскулита и злокачественные процессы [10]. Наиболее полно механизмы латенции изучены у HSV 1-го типа, EBV и вируса герпеса 8-го типа. В период латентной персистенции EBV в клетках в В-клетках памяти включается ряд механизмов, позволяющих вирусу «ускользнуть» от цитотоксического действия клеток хозяина. Вирусный геном в латентной стадии представляет собой кольцевую молекулу, эписому, в отличие от линейной структуры в стадии активной репликации. Такую упаковку DNA обеспечивает один из протеинов, синтезируемых в латентном состоянии, - Эпштейна-Барр-ядерный антиген - Epstein-Barr Nuclear Antigen-1 (EBNA-1). Формирование эписомы ведет к уменьшению фрагментов DNA, вовлекаемых в процесс репликации. Результатом этого является ограничение количества экспрессирующихся латентных протеинов, что уменьшает «узнаваемость» вирусной частицы специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами. Так, из 100 белков, экспрессируемых EBV, в течение латентной персистенции синтезируется только 10: два типа нетранслируемой вирусной RNA, шесть ядерных антигенов и два мембранных протеина. В основе данного механизма лежит деацитилирование DNA промотерной части гена раннего белка BZLF-1, с которого начинается транскрипция всех остальных протеинов в фазе репликации. Белки, синтезируемые в латентную фазу, также способствуют снижению иммуногенности вирусной частицы и стимулируют В-клеточную пролиферацию. Упомянутый ЕBNA-1 ингибирует деградацию белков вируса протеосомами клеток, что, в свою очередь, нарушает презентацию вирусных антигенов цитотоксическими клетками и их активацию. EBNA-2 - ядерный антиген 2-го типа, увеличивает синтез латентного мембранного белка (LMP) 1 и 2-го типов, которые, в свою очередь, участвуют в индукции роста и трансформации В-клеток. LMP-1 по своим функциям аналогичен сигнальной молекуле CD40, рекрутирование которой приводит к В-клеточной пролиферации. LMP-2 располагается в цитоплазматической мембране вместе с комплексом тирозинкиназ, соединенных с В-клеточным рецептором. Блокирование этих тирозинкиназ с помощью LMP-2 при активации В-клеточного рецептора предотвращает реактивацию EBV при латентной инфекции. EBNA-3 - ядерный антиген 3-го типа, участвует в регуляции экспрессии клеточных генов. Нетранслируемая EBV RNA (EBER) не кодирует вирусных белков, но играет большую роль в онкогенезе и блокировании апоптоза клеток. В зависимости от экспрессии латентных протеинов выделяют три формы латентной персистенции. При 1-й форме определяются EBNA-1 и EBER, при 2-й - EBNA-1, LMP-1, LMP-2, EBER, при 3-й - экспрессируются все латентные белки. Различные формы персистенции вируса наблюдаются при разных заболеваниях, ассоциированных с EBV-инфекцией. Вирусная частица состоит из оболочки - суперкапсида, несущей капсидные антигены (вирусный капсидный антиген - VCA и ранний антиген - early antigen - EA) и поверхностные гликопротеины (gp350, gp85, gp42), способствующие внедрению вируса в клетку; из тегамента, включающего белки, необходимые для репликации вируса; ядра, содержащего вирусную ДНК, заключенного в оболочку - нуклеокапсид. Вирусный геном представляет собой двуцепочечную DNA, состоящую примерно из 172 тыс. пар нуклеотидов, кодирующих около 100 протеинов. Одна часть этих белков ответственна за внедрение в клетки-мишени и репликацию вируса. Действие других вирусных протеинов направлено на снижение узнаваемости EBV иммунной системой хозяина в течение латентной персистенции. Несмотря на то что у большинства носителей EBV-инфекция протекает в виде бессимптомного пожизненного носительства, вирус имеет высокий потенциал трансформации клеточной пролиферации. Существует три типа латентной инфекции. При 1-м типе, ассоциированном с развитием лимфомы Беркитта, в В-клетках экспрессируется только EBNA-1-протеин. Тип 2-й латентной инфекции ассоциирован с развитием лимфомы Ходжкина, назофарингеальной карциномы, Т-клеточной лимфомы, карциномы желудка, лейомиосаркомы матки. При латентной EBV-инфекции 2-го типа экспрессируются три вирусных белка: EBNA-1, LMP-1, LMP-2. При 3-м типе латентной инфекции экспрессируются шесть ядерных антигенов EBV (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNALP) и три мембранных белка (LMP-1, LMP-2A, LMP-2B). EBNA-1, LMP-1 и LMP-2, очевидно, являются критическими для туморогенеза, так как индуцируют клеточную пролиферацию и угнетают апоптоз. EBNA-1 потенциирует вирусную репликацию во время пролиферации В-клеток. LMP-1 действует как онкоген, мимикрируя CD40-опосредованную активацию B-клеток, кроме того, экспрессия LMP-1 подавляет bcl-2-индуцированный апоптоз. LMP-2 мимикрирует активацию B-клеток через В-клеточный рецептор [7, 8, 10]. При поддержании баланса между иммунной системой человека и процессами репликации EBV в латентную фазу персистенция вируса в клетках может длиться долгое время. Реактивация EBV-инфекции происходит в результате воздействия на организм хозяина разных внешних факторов, в том числе иммунокомпрометирующих. Это ведет к активации экспрессии раннего медиаторного протеина BZLF-1, или ZEBRA (Z-EBV-активатор репликации), который является триггером вирусной репликации в В-лимфоцитах. ZEBRA способствует активации других ранних медиаторных белков, в том числе DNA-полимеразы и тимидинкиназы, необходимых для DNA-репликации. В результате экспрессируются поздние протеины, включающие капсидные антигены (VCA, gp50) и белки активной фазы [10]. Нами проведены обследование и лечение 79 больных, страдающих раком мочевого пузыря (58 мужчин и 21 женщина) в возрасте от 38 до 90 лет (средний возраст 65±10), поступивших в урологическое отделение ГКБ №68 города Москвы и урологическое отделение Коми республиканского онкологического диспансера в большинстве случаев в экстренном порядке в связи с макрогематурией. Дополнительно к стандартному обследованию выполнен анализ крови на иммуноглобулины (Ig) G, M к герпесу (HSV) 1 и 2-го типов, CMV, EBV, полимеразная цепная реакция (ПЦР) мочи к указанным вирусам, соскоб из уретры на выявление вируса папилломы человека (HPV) высокого онкогенного риска. Проведена ПЦР-диагностика на наличие вирусов HSV 1 и 2-го типов, HPV, CMV, EBV в ткани опухоли мочевого пузыря. Стадия процесса соответствовала T1NxM0 в 52% (у 41 больного), в 1 случае имела место папиллома мочевого пузыря, T2NxM0 - в 25% (у 20 больных), в 16 случаях выявлен местнораспространенный процесс. Трансуретральная резекция стенки мочевого пузыря с опухолью выполнена 61 (77,2%) больному, 10 больным - радикальная цистэктомия с формированием гетеротопического резервуара (в ряде случаев с сигмостомией), 8 пациентам - резекция мочевого пузыря. При патоморфологическом исследовании уротелиальный рак высокой степени злокачественности выявлен в 65,8% (у 52 больных), в 1 случае - папиллома, у 23 больных - рак с низким потенциалом злокачественности, у 2 - плоскоклеточный рак и в 1 случае имела место аденокарцинома сигмовидной кишки. Опухоль была рецидивная у 21 пациента. По результатам нашего исследования антитела класса IgM к CMV не были выявлены ни у одного пациента. Уровни антител класса G к CMV представлены на рис. 1. Как видно из рис. 1, у пациентов с высокодифференцированным, первично выявленным, немышечно-инвазивным уротелиальным раком мочевого пузыря уровень антител к IgG был практически в 2 раза ниже, чем у больных с низкодифференцированным (p=0,07), рецидивным (p=0,0017), местнораспространенным процессом (p=0,0026). Различий между уровнем IgG к CMV у пациентов с единичными или множественными опухолями мочевого пузыря не выявлено. Отмечается умеренная корреляция между уровнем anti-CMV IgG и стадией процесса (R=0,281, p=0,014), уровнем антител к ранним антигенам к EBV (R=0,285, p=0,015). Выявлено наличие высоких коррелятивных связей уровня антител IgG к СMV и рецидивного характера опухоли (R=0,351, p=0,002) и наличия ДНК CMV в опухолевой ткани (R=0,354, p=0,001). На фоне CMV может развиваться инфицирование другими видами вирусов или бактериями, т.е. суперинфекция. Доказано, что CMV инфицирует В-клетки, латентно инфицированные EBV, более эффективно, чем EBV-негативные [11]. Инфекция вируса герпеса человека 6-го типа EBV-позитивных клеточных линий может индуцировать литический репликативный цикл EBV. Подобный сценарий мы наблюдаем, рассматривая наличие высоких коррелятивных связей между наличием различных вирусов в уротелиальной опухоли и их титров у пациентов с разной степенью анаплазии опухоли, стадией процесса и рецидивным характером. Такое взаимовлияние также наблюдается между вирусами одного вида. M.Michaeles и соавт. считают, что CMV может инфицировать опухолевые клетки (не являясь онкогенным вирусом) и модулировать свойства опухоли в сторону появления инвазивных свойств и способности ее к метастазированию, тем самым оказывая онкомодулирующий эффект [5]. Для оказания такого эффекта необходима длительная персистенция вируса в организме. При этом CMV не способен инициировать подобные изменения в неопухолевых клетках. Высокие титры антител IgG к CMV у больных раком мочевого пузыря, особенно рецидивным, свидетельствуют о длительной персистенции этого вируса и периодической его активации. Мы выявили статистически достоверное повышение уровня нуклеарных анти-EBV IgG-EBNA (р=0,037) у пациентов с рецидивным течением заболевания (рис. 2).Антитела класса IgG к EBNA (более 20 ед/мл - положительно) появляются через 1-6 мес после первичной инфекции. Затем их титр уменьшается и сохраняется в течение всей жизни. При реактивации Эпштейна-Барр-вирусной инфекции происходит повторное увеличение их титра [2, 12, 13], возможно развитие разных клинических форм (аутоиммунных процессов, генерализованной инфекции, гемофагоцитарного синдрома и т.д.), в том числе и развитие онкологических заболеваний [12]. Как видно из рис. 2, уровень антител IgG-EBNA у больных с рецидивными опухолями примерно в 2 раза выше, чем с первичными. То есть реактивация вирусной инфекции у этой категории больных в течение жизни происходит чаще, что, возможно, и обусловливает возникновение рецидива. Кроме того, при наличии позитивных лимфоузлов уровень анти-EBV IgG-EBNA был выше (р=0,0257), чем при их отсутствии, т.е. способность к метастазированию у этой категории больных была выше. Наличие высоких титров анти-EBV IgG-EBNA свидетельствует о наличии у этих пациентов хронической EBV-инфекции с периодической ее реактивацией. В нашей группе отрицательные показатели анти-EBV IgG-EBNA выявлены только у 7 больных, при наличии высоких значений анти-EBV IgG-VCA. В 8 случаях показатели анти-EBV IgG-EBNA были сомнительными. У 3 пациентов была выявлена ДНК вируса в опухоли. Что касается повышения показателя антител к капсидному антигену, то он был значительно повышен (средний уровень составил 371,51±296,26 ед/мл), однако статистически достоверных различий между уровнем антител в зависимости от стадии процесса, степени анаплазии и характера опухолевого поражения мы не выявили. Антитела класса IgG к EA достигают высокого титра на 3-4-й неделе острой Эпштейна-Барр-вирусной инфекции и исчезают через 2-6 мес. Они появляются при реактивации, отсутствуют при атипичной форме заболевания. Высокие титры антител к EA выявляют при хронической Эпштейна-Барр-вирусной инфекции, вызванных вирусом раковых и аутоиммунных заболеваниях, иммунодефицитных состояниях [2, 12, 13]. В нашем исследовании мы выявили статистически достоверное повышение уровня ранних антигенов анти-EBV Ig-EA (p=0,02) у больных с местнораспространенным процессом (средний уровень 27,25±40,49 ед/мл) по сравнению с уровнем антител при неинвазивном раке мочевого пузыря (средний уровень 9,89±13,10 ед/мл). Несмотря на то что уровень этих антител по оценочной шкале является отрицательным (менее 20 ед/мл) или сомнительным (от 20 до 40 ед/мл), определяется тенденция роста этого показателя в зависимости от стадии процесса. В нашем исследовании Ig-EA>40 ед/мл (положительный) был выявлен у 6 больных с низкодифференцированными опухолями, в одном случае опухоль была рецидивная, у 3 больных был выявлен мышечно-инвазивный рак (T2-T4), в остальных случаях имело место множественное поражение мочевого пузыря. У 3 больных в опухоли была выявлена ДНК EBV. Таким образом, атипичная реактивация вируса на фоне высоких титров нуклеарных и анти-EBV IgG-VCA, при отсутствии анти-EBV IgМ-VCA имела место у 6 больных. Ранее в нашей работе мы не выявляли какой-либо статистически достоверной зависимости уровня антител IgG к HSV 1, 2-го типов у больных раком мочевого пузыря. Однако по мере накопления клинического материала мы обнаружили статистически достоверную разницу в уровне антител к указанным вирусам у пациентов с опухолями высокого и низкого потенциала злокачественности (p=0,03). Так, средние показатели уровня IgG к HSV 1, 2-го типов у больных с высокодифференцированными опухолями составили 17,32±7,69 инд. поз. vs 21,32±6,99 инд. поз. у пациентов с низкодифференцированными опухолями. Уровень IgG к HSV 1, 2-го типов коррелировал с уровнем EA к EBV (R=0,306, p=0,009). Ряд авторов указывают на способность HSV индуцировать хромосомные аберрации инфицированных клеток макроорганизма [14, 15] даже в условиях абортивной инфекции; способность к амплификации ДНК онкогенных вирусов после инфицирования HSV указывает на непрямое влияние HSV 1 и 2-го типов на онкогенез человека [7, 16]. Наличие вирусных ДНК в опухолевой ткани было выявлено у 24 (30% случаев) больных. У 15 больных в опухоли выявлено наличие ДНК EBV, у 2 - CMV, в 4 случаях - HPV высокого онкогенного риска (16, 39, 45, 52, 59), в 1 случае - HSV 1, 2-го типов, в 2 случаях выявлено 2 вируса (HPV+EBV и EBV+СMV). Чувствительность ПЦР для определения наличия ДНК EBV составляет 70-75%, что значительно ниже, чем при других герпес-вирусных инфекциях (95-100%). Это связано с появлением вируса Эпштейна-Барр в биологических жидкостях лишь при иммуноопосредованном лизисе инфицированных В-лимфоцитов [2, 13]. Следует сразу оговориться, что в большинстве случаев выполнялась трансуретральная резекция стенки мочевого пузыря с опухолью. При небольших размерах опухоли возможна недостаточная для определения концентрация ДНК вируса в материале, вследствие чего даже при наличии высоких уровней антител ДНК вируса в опухоли не выделялось. H.zur Hausen в своей монографии, посвященной этиологической роли вирусов в генезе опухолей различной локализации, указывает на присутствие вирусной ДНК в опухоли, индуцированной вирусом, в очень малом количестве - примерно одна вирусная ДНК на 10 опухолевых клеток, что, в свою очередь, затрудняет диагностику [7]. В отличие от других инфекционных заболеваний (холера, дифтерия, туберкулез и т.д.), при которых возможно смоделировать инфекционный процесс на животных и доказать непосредственную этиологическую роль инфекций, вирусные инфекции отличаются длительным персистированием, начиная от первичных проявлений инфекционного процесса и заканчивая появлением опухоли. Период латенции может длиться несколько десятилетий, и доказать прямую этиологическую зависимость между вирусной инфекцией и онкогенезом очень трудно. Потенцирование онкогенных свойств одних вирусов на фоне инфицирования другими опосредованно приводит к индукции опухолевого роста даже на фоне абортивной инфекции. Именно белки латенции приводят к снижению иммунного статуса макроорганизма, его несостоятельности и формированию опухолей различной локализации [7]. По мнению В.Э.Гурцевича, широкое распространение EBV, обладающего выраженными трансформирующими потенциями, среди населения планеты и редкое возникновение в инфицированной популяции связанных с этим вирусом опухолей с преимущественной их локализацией в определенных географических регионах и этнических группах позволяет сделать вывод, что подобно большинству опухолей иной вирусной природы в патогенезе EBV-ассоциированых образований важную роль играют дополнительные факторы и одного EBV недостаточно для возникновения опухоли. EBV лишь инициирует пролиферацию инфицированных им клеток, а последующие события влияют на гистопатологический спектр возникающих неоплазий [17]. В нашей работе выявлено статистически достоверное повышение уровня вирусных антител у больных рецидивным, местнораспространенным раком мочевого пузыря высокого потенциала злокачественности; статистически значимые коррелятивные связи между наличием вирусных ДНК CMV и EBV в опухоли, уровнем их антител, стадией процесса и рецидивным характером опухоли. Все нами изложенное диктует необходимость продолжения исследования для получения статистически достоверных данных по другим показателям, определения типа латенции и роли вирусов в этиологии возникновения рака мочевого пузыря.

About the authors

O B Loran

Russian Medical Academy of Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: oleg_loran@gmail.com
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L A Sinyakova

Russian Medical Academy of Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: l.a.sinyakova@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L V Gundorova

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: ludovik-213@mail.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

V A Kosov

Komi Republican Oncologic Hospital

Email: zinaidakosova@yandex.ru
167904, Russian Federation, Syktyvkar, pgt Krasnozatonskii, Niuvchimskoe shosse, d. 46

I V Kosova

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: kosovainga@mail.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

D N Kolbasov

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: urology68@rambler.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

I V Kononkov

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: urology68@rambler.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

References

Supplementary files