ACTION OF A HIGH-INTENSITY PULSED MAGNETIC FIELD ON A HUMAN DERMAL FIBROBLASTS IN CULTURE

全文:

ПОСТАНОВКА ВОПРОСА Современная медицина требует новых подходов к диагностике и лечению социально значимых заболеваний. При этом на первый план выдвигается использование неинвазивных технологий, что может существенно улучшить результаты лечения и повысить качество жизни пациентов. В частности, в регенеративной медицине возрастает роль неинвазивных методов, связанных с использованием магнитных полей в лечебной практике. В настоящее время широко применяются постоянные, переменные и импульсные магнитные поля (ПМП, ПеМП и ИМП) с невысокими значениями магнитной индукции (до 100 мТл) [1-5]. По мнению большинства авторов [6-10], в основе биологического и лечебного действия магнитных полей лежат изменения в состоянии клеточных мембран, ферментативных и рецепторных молекул, повышением проницаемости плазмолеммы клеток. Магнитные поля широко применяются в технике, но их параметры значительно отличаются от используемых в медицине. В последнее время на машиностроительных предприятиях внедрены процессы магнитно-импульсной штамповки, сборки, сварки [11]. Источником импульсных магнитных полей (ИМП) в этих процессах является индуктор [12], соединённый с магнитно-импульсной установкой (МИУ) [13]. В процессе разряда батареи конденсаторов МИУ на индуктор, в образованной таким образом разрядной цепи, протекает ток, характер изменения которого показан на рисунке 1. Из приведенных осциллограмм видно, что характер протекающего тока зависит от сопротивления разрядной цепи: периодический разряд - затухающая синусоида или апериодический разряд. Интенсивность магнитного поля зависит от количества энергии , запасённой в батарее конденсаторов магнитно-импульсной установки, которая для используемых индукторов определяет уровень напряженности. В таблице 1 представлены значения параметров ИМП наиболее часто используемых в технике. Видно, что параметры ИМП получаемых в технике, при токах в разрядной цепи 10-100 кА, на порядки отличаются от значений, которые используются в цитируемых выше медицинских работах. Целью данного исследования является изучение воздействия импульсного магнитного поля высокой напряженности на культуру дермальных фибробластов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Техническая составляющая. На рисунке 2 представлены схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дермальных фибробластов человека. С помощью датчиков Холла получены картины распределения магнитного поля «H» в двух координатах. Параметры используемой магнитно-импульсной установки приведены в таблице 2. На рисунке 3 представлен внешний вид индукторов. Эксперименты проводились при W = 500 Дж и 1000 Дж. Осциллограммы напряженности магнитного поля при W = 1000 Дж представлены на рисунке 4. Частотные характеристики индуктора с замкнутым контуром и плоского индуктора составляют 18,9 кГц и 19,7 кГц соответственно, что находится в одном диапазоне частот. Биологическая составляющая. Научное исследование воздействия магнитно-импульсной установки «МИУ-Био» было проведено на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа. Забор первичного материала (биоптатов кожи) для выращивания культуры фибробластов производили у соматически здоровых и обследованных доноров после получения добровольного информированного согласия и одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ. Фибробласты выращивали по методике первичных эксплантатов (К.Н. Гринберг и соавт., 1988) [14]. Для проведения эксперимента фибробласты снимали со дна культурального флакона стандартным методом и высевали в культуральные чашки Петри диаметром 3,5 см в дозе 1х104 кл./см2. Культивирование проводили в условиях СО2-инкубатора (Sanyo - Incubator, MCO-18AС, Япония) при температуре 37°С, 5% СО2 и постоянной влажности в полной ростовой среде (среда 199 - 90%, эмбриональная телячья сыворотка - 10% (ООО «БиолоТ», РФ), гентамицин - 40 мкг/мл). Количество чашек - 40. По достижению клетками конфлуентного монослоя чашки были разделены следующим образом: 2 опытные серии (в каждой по 16 чашек) и 2 контрольные серии (в каждой по 4 чашки, на которые не было оказано воздействие магнитным полем); опытные серии делили на 2 подгруппы соответственно энергии облучения. В 1 серии воздействие магнитным полем оказывали в продольном направлении, во 2 серии - в поперечном. Опытные чашки подвергали однократному облучению магнитно-импульсным полем при энергиях 500 Дж и 1000 Дж. Длительность наблюдения составляла 48 часов после воздействия ИМП ВН. Проводили наблюдение за состоянием клеток в монослое и фотографирование их при помощи аппаратно-программного комплекса (АПК), состоящего из инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры Olympus SC100 («Olympus», Корея) и стационарного компьютера. Для обработки изображений использовали программное обеспечение CellSens Standart 1.7 («Olympus Corporation», Япония). Непосредственно перед началом воздействия, а затем в конце эксперимента монослой окрашивали суданом IV и гематоксилином для общеморфологического анализа и витальными красителями для выявления жизнеспособных и поврежденных клеток (трипановый синий и флуоресцентный набор LIVE/DEAD ® (Invitrogen, США)). Анализ изображений окрашенных препаратов производили с помощью системы визуализации на основе исследовательского люминесцентного микроскопа Leica DMIL LED (Германия) с флуоресцентным блоком. РЕЗУЛЬТАТЫ При осмотре контрольных чашек: монослой равномерный, характер роста в виде завитков (рис. 5а). Клетки близко расположены друг к другу, имеют 2-3 отростка. Форма клеток веретенообразная, контуры четкие, цитоплазма гомогенная, слабо оксифильная. Ядра расположены в основном эксцентрично, содержат 2-3 ядрышка (рис. 5а), выявлены делящиеся клетки (рис. 5б). При окрашивании клеток витальным красителем трипановым синим все клетки прозрачные (жизнеспособные), окрашенных в синий цвет (поврежденных) не выявлено (рис. 5в). При обработке монослоя флуоресцентным набором LIVE/DEAD ® клетки приобрели зеленое свечение, что подтверждает их жизнеспособность; клетки со светящимся красным ядром единичные (рис. 5г). Серия 1а. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 3,76⋅106 А/м (500 Дж) При однократном воздействии магнитным полем в продольном направлении с энергией 500 Дж через 48 часа отмечено, что клетки изменили свое расположение на дне культурального пластика в результате воздействия силовых линий магнитного поля (рис 6а). Клетки сохранили свои характерные морфологические особенности, но стали более вытянутыми. Контуры клеток четкие, цитоплазма гомогенная (рис. 6 б). Соотношение жизнеспособных и поврежденных клеток соответствовало таковому в контрольной культуре (рис. 6в, 6г). Серия 1б. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 4,42⋅106 А/м (1000 Дж.) При продольном воздействии ИМП ВН с энергией 1000 Дж через 48 часов на дне чашки зафиксировано смещение клеток в монослое по ходу воздействия магнитного поля (рис. 7а), в клетках при обзорной окраске суданом IV и гематоксилином выявлены поврежденные клетки с разрушенными ядрами (кариопикноз, кариорексис) (рис.7б). При окраске монослоя трипановым синим, были обнаружены поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис.7в). При обработке монослоя флуорофорами отмечали большое количество ядер с красной люминесценцией, что свидетельствовало об их повреждении (рис. 7г). Серия 2а. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 7,1⋅106 А/м (500 Дж) При поперечном воздействии при 500 Дж через 48 часов при осмотре клеток в монослое наблюдали изменение характера роста клеток с изменением геометрического рисунка (рис.8а). При обзорных окрасках отметили, что клетки п стали более вытянутыми, отростки были длиннее, чем в контрольной серии. В некоторых клетках наблюдали зернистость цитоплазмы и просветление вокруг ядер (рис.8б). При окраске трипановым синим выявляли поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис. 8в). Обработка монослоя флуоресцентным красителем позволила обнаружить выявить погибшие клетки с красной люминесценцией ядер (рис. 8г). Серия 2б. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 8,7⋅106 А/м (1000 Дж) При воздействии ИМП ВН энергией 1000 Дж в поперечном направлении в момент облучения крышка чашки Петри лопнула. Через 48 часов при окраске монослоя суданом IV и гематоксилином были обнаружены коагуляционные участки в виде темных клубков с хаотично расположенными клетками, границы которых не визуализировались (рис. 9а). Большинство фибробластов в монослое деформированы, в их цитоплазме наряду с плотными имеются разряженные участки. Контакты между клетками нарушены. Также на поверхности культурального пластика можно видеть фрагменты цитоплазмы, лишенные ядер и обрывки отростков. В клетках ядра деформированы, визуально плотные, структура их не однородная, ядрышки отсутствовали (рис. 9б). Получить изображения клеток с помощью витальных красителей (трипановым синим и набором LIVE/DEAD®) не удалось, так как клетки в результате пробоподготовки были смыты со дна культуральных чашек, что свидетельствовало об ослаблении адгезии клеток к культуральному пластику под действием данного режима. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В рамках данной работы были спроектированы специализированная магнитно-импульсная установка и измерительный стенд, позволившие получить ИМП с разными параметрами воздействия. Разработаны и опробованы схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дермальных фибробластов с использованием индукторов различных конструкций, для которых была получена топология поля. По результатам экспериментов установлено: Факт влияния импульсного магнитного поля высокой напряженности на биологический объект, а именно культуру дермальных фибробластов; Воздействие ИМП ВН в продольном направлении при энергии 500 Дж не вызывает повреждения структуры фибробластов в культуре. Данный режим является безопасным для здоровых первичных культур клеток; При поперечном воздействии как при 500 , так и при 1000 Дж имеет место повреждение данной популяции клеток вплоть до их гибели; Намечены пути модернизации магнитно-импульсных установок, с целью управлениями параметрами воздействия ИМП на культуры клеток

作者简介

V. Glushchenkov

Samara Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: vgl@ssau.ru
Samara, Russia

L. Volova

Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University

Email: volovalt@yandex.ru
Samara, Russia

I. Belyaeva

Samara National Research University named after Academician S.P. Korolyov

Email: belyaeva-ommr@yandex.ru
Samara, Russia

V. Boltovskaya

Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University

Email: violetta.boltovskaya@yandex
Samara, Russia

V. Rossinskaya

Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University

Email: rossinskaya_v_v@mail.ru
Samara, Russia

A. Ignatenko

Samara National Research University named after Academician S.P. Korolyov

Email: mc-alexsandro@bk.ru
Samara, Russia

I. Nefedova

Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University

Email: bobrovka2012@yandex.ru
Samara, Russia

L. Kulagina

Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University

Email: lnkulagina07@mail.ru
Samara, Russia

参考

补充文件