PECULIAR FEATURES OF PROTEIN COMPOSITION OF THE LACRIMAL FLUID IN CHILDRENAND ADOLESCENTS WITH HIGH PROGRESSIVE MYOPIA

Abstract


The objective of the present work was to elucidate peculiar features of protein composition of the lacrimal fluid in children and adolescents with high progressive myopia. Thirty five samples of the lacrimal fluid obtained from35 children and adolescents at the age from 10 to 17 (mean 13,1 ± 2,2) years with myopia (5,0 – 20,5 D, mean9,5 ± 3,7 D) developing at the annual progression rate of 0,98 ± 0,8 D. were available for the analysis. Nineteenpatients had various forms of peripheral vitreochorioretinal dystrophy. None of the patients included in the studyused contact lenses to correct myopia. Nine samples of lacrimal fluid were taken from children and adolescents ofthe same age with emmetropy without changes in the eye fundus. The samples of lacrimal fluid from the patientsof the two groups were significantly different in that they contained much less total protein in the children withhigh progressive myopia compared with the control subjects. At the same time, the relative amount of lactoferrin(one of the major proteins of lacrimal fluid exhibiting antioxidative and metal-chelating activities) in the formergroup was significantly higher. The results of the study on the one hand confirm the pathogenetic role of thedisorders in the antioxidative protective system of the eye tissues and media and on the other hand give reasonto consider the reduction of the total protein content and the rise in the lactoferrin fraction in the lacrimal fluid asthe diagnostic signs of progressive development of the myopic process.

Full Text

Согласно современным представлениям, одним из ведущих патогенетических факторов возникно- вения и прогрессирования миопии, сопровождаю- щегося удлинением глазного яблока в передне-заднем направлении, является растяжение и осла- бление склеральной оболочки глаза, связанное с развитием в ее соединительной ткани дистрофиче- ского процесса [1—4]. Углубленные морфологические и биохимические исследования изолированной склеры глаз с близо- рукостью высокой степени выявили существенные нарушения ее экстрацеллюлярных соединитель- нотканных структур, прежде всего связанные с из- менениями в обмене белков, в частности, коллагена [1, 2, 5—7]. Однако прижизненная оценка белково- го обмена, в том числе обмена коллагена и других компонентов соединительнотканного матрикса, у пациентов с миопией проводилась только на систем- ном уровне [8—12]. В частности, было установлено увеличение экскреции оксипролина — маркерной аминокислоты коллагена и гликозаминогликанов (ГАГ) — основного компонента межуточной суб- станции соединительной ткани, а также повышение в сыворотке крови детей и подростков с прогресси- рующей миопией уровня свободного оксипролина и активности гиалуронидазы — лизосомального фер- мента, расщепляющего ГАГ [2, 8]. В последние годы для оценки локальных биохи- мических изменений обмена веществ в тканях глаза используют слезную жидкость (СЖ) как наиболее доступный биологический объект, в определенной степени отражающий метаболические процессы, происходящие в глазу в норме и при патологии [13— 17]. Выявление корреляции биохимического состава слезы с наличием и выраженностью изучаемой оф- тальмопатологии может расширить представление о ее патогенезе и помочь в диагностике, оценке про- гноза и выборе патогенетически ориентированной терапии. Вместе с тем, работ, посвященных изучению бел- кового состава СЖ при прогрессирующей миопии, в доступной литературе мы не встретили. Целью настоящей работы является изучение особенностей белкового состава СЖ детей и подрост- ков с высокой прогрессирующей миопией. Материал и методы. Объектом исследования являлись 35 образцов СЖ, взятых у 35 детей и под- ростков (20 девочек, 15 мальчиков) в возрасте от 10 до 17 лет (средний возраст М ± σ: 13,1 ± 2,2 лет) с миопией от 5,0 до 20,5 дптр (в среднем М ± σ: 9,5 ± 3,7 дптр) и средним градиентом прогрессирования М ± σ: 0,98 ± 0,8 дптр/год, из них у 19 детей выявлены различные формы периферических витреохориоретинальных дистрофий. Все включенные в исследование пациенты не пользовались для коррекции миопии контактными линзами. Группу контроля составили образцы СЖ 9 детей и подростков с эмметропией (6 девочек, 3 мальчика) в возрасте 10—13 лет (средний возраст М ± σ: 12,4 ± 0,5 лет) без изменений на глазном дне. СЖ набирали в утренние часы после раздражения слизистой носа с помощью ингаляции 10% раствора гидроксида аммония из нижнего конъюнктивального свода одного глаза микрокапилляром в объеме 100 мкл и помещали в сухую герметичную пробирку. Сразу после забора пробы СЖ замораживали при температуре -18oC. Как показано в работе R. Fullard и C. Snyder [18], содержание некоторых белков в СЖ, в том числе лактоферрина и лизоцима, уровень которых оценивался в данной работе, не зависит от метода ее получения (стимулированная и нестимулированная СЖ). 28 В пробах СЖ определяли содержание общего белка по методу М.М. Bradford [19]. Качественное определение белкового состава и содержания бел- ков в СЖ проводилось методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), поскольку он считается одним из наиболее экономичных и до- ступных методов для решения этой задачи [20]. В данной работе белки проб СЖ разделяли с по- мощью одномерного гель-электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и окрашивали раствором Ку- масси. Количественное определение содержания лактоферрина и лизоцима проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с ис- пользованием двух различных первичных антител к изучаемым белкам, так называемый «сэндвич- метод» (ELISA) [21]. На твердой фазе были иммо- билизованы аффинно-очищенные поликлональные антитела к лизоциму — sheep anti-human Lysozyme (Serotec) и моноклональные антитела к лактоферри- ну — mouse anti-human Lactoferrin (Serotec). Парами к этим антителам были выбраны антитела кролика к лизоциму человека (GenWay) и антитела кролика к лактоферрину человека (GenWay). В качестве вто- ричных антител к иммуноглобулинам кролика бы- ли использованы афинно-очищенные козлиные ан- титела к тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов кролика класса Ig, конъюгированные с пероксида- зой хрена (Blotting Grade Affinity Purified Goat anti Rabbit IgG (H+L) Horseradish Peroxidase Conjugate (Bio Rad)). В качестве субстрата для ферментатив- ной цветной реакции применяли тетраметилбензи- дин. Абсорбционность измеряли на спектрофото- метре Star Fax 2100 при длине волны поглощения 450 нм и дифференциальной длине волны 630 нм. Для построения калибровочных кривых использо- вали рекомбинантные лизоцим и лактоферрин че- ловека (USBiological). Статистический анализ полученных данных про- веден с помощью программы Microsoft Excel и паке- та статистических программ STATISTICA 6.0. Рас- считывали медианы и оценивали диапазон с 50% всех значений (квартили — 25% и 75%). Значимость различий средних величин количественных призна- ков оценивалась непараметрическими методами по U-критерию Манна—Уитни для двух независимых групп. Различия считались достоверными в случае р < 0,05. Результаты и обсуждение. На первом этапе про- водилось определение общей концентрации белка в СЖ пациентов с различной рефракцией, которое по- казало, что при высокой миопии этот показатель до- стоверно ниже, чем при эмметропии (рис. 1): 5,65 (4,85; 6,333) мг/мл и 7,66 (6,83; 8,16) мг/мл соответ- ственно (р = 0,000408). В связи с этим необходимо было определить, явля- ется ли обнаруженное снижение общей концентрации белка следствием общей депрессии синтетической активности или отражает снижение концентрации каких-либо отдельных белковых компонентов слезы при миопии высокой степени? Качественное определение содержания белков в СЖ методом SDS-электрофореза в ПААГ показало, что основными белками СЖ являются лизоцим, лак- тоферрин, липокалин (они составляют 70—85% всех Российская педиатрическая офтальмология, №2, 2013 Т аб лица 1 Отношение содержания лактоферрина (Ltf) к лизоциму (Lys), а также отношение содержания этих белков к общему содержанию белка (ТРС) в СЖ детей и подростков с прогрес- сирующей миопией высокой степени и эмметропией (контрольная группа), мг/мл П р и м е ч а н и е. * — различие показателей достоверно. Рис. 1. Содержание основных белков (лактоферрина и лизоцима), а также общего белка (мг/мл) в СЖ детей и подростков с эмметропией (контрольная группа) и про- грессирующей миопией высокой степени. секретируемых белков), а также трансферрин и секре- торный IgA [20]. При разделении этим методом бел- ков СЖ обследованных нами пациентов с эмметропи- ей и миопией высокой степени мы обнаружили, что мажорным белкам соответствуют полосы на уровне ~80 кДа и 19 кДа, в которых, согласно литературным данным, находятся лактоферрин и лизоцим [22]. Для более точного количественного определения содержания данных белков в СЖ далее использовал- ся метод ELISА. Полученные результаты представ- лены на рис. 1. Как видно из данных, представленных на рис. 1, при миопии высокой степени концентрация лизоцима оказалась несколько сниженной по сравнению с эм- метропией — 1,15 (0,9; 1,36) мг/мл и 1,55 (1,20; 1,97) мг/мл соответственно. Концентрация лактоферрина, наоборот, при миопии высокой степени была несколь- ко выше, чем при эмметропии, — 2,04 (1,77; 2,56) мг/ мл и 1,79 (1,56; 2,25) мг/мл соответственно. Однако для обоих белков эти изменения не были статистиче- скими достоверными, p = 0,08 (на уровне тенденции статистической значимости) для лизоцима и p = 0,26 для лактоферрина (р > 0,05). Таким образом, изменения в концентрации лизо- цима и в общей концентрации белка характеризуются одной и той же тенденцией: наблюдается их сниже- ние при миопии высокой степени. При этом доля ли- зоцима в общей концентрации белка (лизоцим/общий белок) остается постоянной и составляет 0,19 (0,16; 0,25) мг/мл при миопии высокой степени и 0,19 (0,17; 0,25) мг/мл при эмметропии (табл. 1). Как было отмечено выше, концентрация лактоферрина при прогрессирующей миопии высокой степени оказалась несколько повышенной (см. рис. 1). Поскольку общая концентрация белка снижена, доля лактоферрина в общей концентрации белка при миопии высокой степени оказалась существенно (в 1,6 раза) выше, чем при эмметропии (в контрольной группе) — 0,23 (0,2; 0,29) и 0,37 (0,33; 0,43) мг/мл соответственно), различие высоко достоверно (р = 0,000185). При этом, как показывают данные табл. 1, соотношение содержания в СЖ лактоферрина и лизоцима при вы- сокой миопии также достоверно выше (в 1,7 раза), чем у пациентов с эмметропией (р = 0,006754), не- смотря на значительный индивидуальный разброс уровня этих белков в обеих группах. Полученные результаты позволяют сделать вы- вод о том, что характер изменений уровня лизоцима совпадает с изменениями общей концентрации бел- ка и, вероятно, связан со снижением при прогресси- рующей миопии синтетической активности белков соединительной ткани. В то же время изменения в концентрации лактоферрина носят противополож- ный характер и, вероятно, объясняются другими причинами. Для выявления возможной связи между снижени- ем содержания общего белка и лизоцима, а также по- вышением относительной доли лактоферрина в СЖ в развитии миопических осложнений, данные показа- тели были определены отдельно у детей и подростков с различным характером течения миопического про- цесса (осложненным и неосложненным). Получен- ные данные представлены на рис. 2 и в табл. 2. Полученные результаты не выявили значимых различий: при осложненной миопии высокой сте- Рис. 2. Концентрация лактоферрина и лизоцима (мг/мл), а также общее содержание белка в СЖ детей и подрост- ков с осложненной и неосложненной миопией высокой степени. 29 Российская педиатрическая офтальмология, №2, 2013 Т аб лица 2 Отношение содержания лактоферрина (Ltf) к лизоциму (Lys), а также отношение содержания этих белков к общему содержанию белка (ТРС) в СЖ детей и подростков с ослож- ненной и неосложненной прогрессирующей миопией высо- кой степени, мг/мл (медиана, квартили) Показатель Миопия p Показатель осложненная неосложненная p Ltf/TPC 0,38 (0,32; 0,42) 0,37 (0,33; 0,45) 0,816699 Lys/ТРС 0,21 (0,18; 0,24) 0,18 (0,12; 0,26) 0,425031 Ltf/Lys 1,79 (1,54; 2,25) 2,19 (1,44; 2,96) 0,382284 пени концентрация лизоцима в СЖ составила 1,15 (1,06; 1,33) мг/мл, при неосложненной — 1,11 (0,59; 1,53) мг/мл, концентрация лактоферрина при ослож- ненной — 2,16 (1,6; 2,56) мг/мл, при неосложненной несколько (недостоверно) ниже — 1,96 (1,83; 2,54) мг/мл. Уровень общего белка также практически не различался у обследованных детей с различным те- чением миопического процесса, а доля лактоферрина (показатель Ltf/TPC) составила соответственно 0,38 (0,32; 0,42) и 0,37 (0,33; 0,45) мг/мл. Таким образом, можно заключить, что выявленные особенности бел- кового состава СЖ в основном связаны с процессом прогрессирования миопии и не отражают впрямую наличие дистрофических изменений сетчатки миопи- ческого генеза. Можно предположить, что впервые выявленное снижение в СЖ содержания общего белка и одного из мажорных белков СЖ — лизоцима (при посто- янстве его относительной доли) при миопии высо- кой степени является следствием общей депрессии синтетической активности протеинов в период про- грессирования миопии. Известно, что кроме своей антибактериальной функции, лизоцим также прини- мает участие в защитных иммунных реакциях, а так- же в процессах регенерации и заживления ран [16]. В связи с этим в пользу высказанного предположе- ния говорят имеющиеся данные о снижении уровня биосинтеза основного соединительнотканного белка (коллагена) в миопической склере и об увеличении доли его растворимой фракции при одновременном снижении доли нерастворимого коллагена, т. е. о преобладании процессов катаболизма этого белка над его синтезом [2, 8]. Показано также, что у боль- ных с прогрессирующей миопией активность проте- аз в СЖ достоверно выше нормы — на 59,1% и на 34,6% выше, чем у больных с косоглазием (p < 0,01 в обоих случаях), а также достоверно снижена анти- протеолитическая активность (на 30,6% в сравнении с таким показателем у здоровых лиц, р < 0,05) [11], что является признаком нарушения белкового обме- на при прогрессирующей миопии, проявляющегося на уровне СЖ. В то же время установленное нами повышение относительной доли лактоферрина (как по отноше- нию к общему содержанию белка в СЖ, так и по отношению к уровню лизоцима), очевидно, отража- ет другие процессы, связанные с прогрессировани- ем миопии. Как известно, лактоферрин — железо- содержащий гликопротеид, обладает множеством разнообразных функций, основными из которых 30 являются антибактериальная, противовоспалитель- ная, антиоксидантная и металлохелатная [23, 24]. Последние две представляют большой интерес для данного исследования, поскольку ранее было по- казано, что в СЖ при прогрессирующей миопии меняются показатели, характеризующие состояние антиокислительной системы, а также увеличивается содержание железа, обладающего прооксидантным действием [2]. При развитии патологических изме- нений глазного дна, связанных с прогрессирующей миопией, активизируются процессы перекисного окисления липидов при одновременном ослабле- нии антиокислительной защитной системы, как на уровне организма, так и непосредственно в органе зрения. Продукты свободнорадикального окисле- ния и активные формы кислорода оказывают по- вреждающее действие на соединительнотканные и другие структуры оболочек глаза [13, 25], что явля- ется существенным фактором прогрессирующего и осложненного течения миопии. Учитывая то, что доля лактоферрина в суммарном белковом соста- ве СЖ значительна, его антиоксидантное действие может вносить существенный вклад в общую анти- окислительную активность сред и тканей глаза и тем самым препятствовать развитию миопического процесса. Повышение концентрации лактоферрина в СЖ при миопии высокой степени может свиде- тельствовать о компенсаторной реакции организма, направленной на борьбу с активацией окислитель- ных процессов, происходящих при прогрессирова- нии заболевания. Если принять это предположение, то можно рассматривать повышение относительной доли лактоферрина в СЖ как диагностический при- знак, свидетельствующий о прогрессирующем ха- рактере течения миопии. Заключение Проведенное сравнительное изучение белкового состава СЖ у детей и подростков с прогрессирующей миопией высокой степени и эмметропией позволи- ло выявить определенные отличия, характерные для изучаемой офтальмопатологии, а именно достовер- ное снижение при миопии общего содержания бел- ка и одновременное повышение доли лактоферрина, одного из мажорных протеинов СЖ, обладающего среди других функций антиоксидантным и металло- хелатным действием. Полученные данные, с одной стороны, подтверждают патогенетическую роль на- рушения антиоксидантной защитной системы сред и тканей глаза в развитии миопического процесса, а с другой — позволяют рассматривать снижение со- держания общего белка и повышение относительной доли лактоферрина в СЖ как возможные диагности- ческие признаки прогрессирующего характера мио- пического процесса.

About the authors

Elena Naumovna Iomdina

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: iomdina@mail.ru
105062, Moscow, Russian Federation

Elena Petrovna Tarutta

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: elenatarutta@mail.ru
105062, Moscow, Russian Federation

Irina Mihajlovna Kuryleva

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: imkuryleva@gmail.com
105062, Moscow, Russian Federation

Yuliya Mihajlovna Aksenova

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: dr.aksyonova.yuliya@gmail.com
105062, Moscow, Russian Federation

Elena Anatol'evna Surina

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: surinae@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Irina Vladimirovna Smirnova

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: smirnova@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Anna Pajzenovna Bogachuk

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: apbog@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Valerij Mihajlovich Lipkin

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: vmlipkin@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

References

  1. Аветисов Э.С. Близорукость. М.: Медицина; 1999.
  2. Иомдина Е.Н. Биомеханические и биохимические нарушения склеры при прогрессирующей близорукости и методы их коррекции. В кн.: Аветисов С.Э., Кащенко Т.П., Шамшинова А.М., ред. Зрительные функции и их коррекция у детей. М.: Медицина; 2006: 163—83.
  3. Тарутта Е.П. Осложненная близорукость: врожденная и приобретенная. В кн.: Аветисов С.Э., Кащенко Т.П., Шамшинова А.М., ред. Зрительные функции и их коррекция у детей: Руководство для врачей. М.: Meдицинa; 2005: 137—63.
  4. Curtin B.J. The myopias: Basic science and clinical management. Philadelphia: Harper and Row; 1985.
  5. Андреева Л.Д. Структурные особенности склеры при миопии и эмметропии: Дисс. М.; 1981.
  6. McBrien N.A., Gentle A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia. Progr. Retin. Eye Res. 2003; 22: 307—38.
  7. Rada J.A., Shelton S., Norton T.T. The sclera and myopia. Exp. Eye Res. 2006; 82 (2): 185—200.
  8. Винецкая М.И., Болтаева З.K., Иомдина E.H., Андреева Л.Д. Биохимические аспекты прогрессирующей миопии. Офтальмологический журнал. 1988; 3: 155—8.
  9. Баннур Р. Молекулярно-генетические маркеры генов метаболизма коллагена в прогнозировании течения миопии у детей: Дисс. M.; 2011.
  10. Бикбов М.М., Даутова З.А., Саматова P.P. и др. Некоторые биохимические показатели крови при приобретенной близорукости у детей. Вестник российской военно-медицинской академии. 2009; 3 (27): 52—4.
  11. Бушуева Н.Н., Коломийчук С.Г., Шариф А.А. Активность трипсиноподобных протеаз и антипротеолитическая активность в сыворотке крови и слезной жидкости у детей и подростков с прогрессирующей близорукостью. Офтальмологический журнал. 2002; 4: 31—4.
  12. Саматова P.P. Разработка методов прогноза и лечения прогрессирующей миопии у детей: Дисс. М.; 2011.
  13. Винецкая М.И., Иомдина Е.Н., Кушнаревич Н.Ю. и др. Значение показателей перекисного окисления липидов и антирадикальной защиты слезной жидкости для прогнозирования и лечения осложненной близорукости. Вестник офтальмологии. 2000; 5: 54—5.
  14. Петрович Ю.А., Терехина Н.А. Биохимия слезы и ее изменение при патологии. Вопросы медицинской химии. 1990; 3: 13—8.
  15. Сомов Е.Е., Бржеский В.В. Слеза (физиология, методы исследования, клиника). СПб.; 1994.
  16. Чеснокова Н.Б., Безнос О.В. Гидролитические ферменты слезной жидкости в норме и патологии. Российский офтальмологический журнал. 2012; 5 (4): 107—11.
  17. Ohashi Y., Dogru M., Tsubota К. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin. Chim. Acta. 2006; 369 (1): 17—28.
  18. Fullard R., Snyder C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 1990; 31 (6): 1119—26.
  19. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram auantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 1976; 72: 248—54.
  20. Kuizenga A., van Haeringen N.J., Kijlstra A. SDS-minigel electrophoresis of human tears. Effect of sample treatment on protein patterns. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991; 32: 381—6.
  21. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971; 8: 871—4.
  22. Ng V., Cho P., Wong F., Chan Y. Variability of tear protein levels in normal young adults: diurnal (daytime) variation. Graefe’s Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2001; 239: 257—63.
  23. Ward P.P., Paz E., Conneely O.M. Multifunctional roles of lactoferrin: a critical overview. Cell. Mol. Life Sci. 2005; 62: 2540—8.
  24. Flanagan J.L., Willcox M.D. Role of lactoferrin in the tear film. Biochimie. 2009; 91 (1): 35—43.
  25. Кушнаревич Н.Ю. Критерии перехода миопии в осложненную форму: Дисс. М.; 2000.

Statistics

Views

Abstract - 39

PDF (Russian) - 1

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

Refbacks

  • There are currently no refbacks.


Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies