The influence of melatonin and dexamethasone instillations on the clinical course of uveitis and the biochemical processes in the aqueous humour of the anterior chamber of the eye (an experimental study)

Full Text

Введение. Пациенты с увеитами и их осложнениями составляют от 5 до 18 % больных глазных стационаров. При тяжелых формах заболевания слепота на оба глаза развивается в 10-15%, а инвалидность по зрению составляет около 30% [1, 2]. Полиэтиологичность увеитов и сложность их патогенеза существенно затрудняют выбор препаратов для лечения. В настоящее время кортикостероидные препараты занимают ведущее место в лечении эндогенных увеитов у взрослых и детей. Однако при длительном применении препаратов этой группы, особенно в больших дозировках, частота развития побочных эффектов достигает 50% [3-5]. Основные патогенетические факторы увеита можно разделить условно на инфекционные, аутоиммунные, а также неизвестной природы. Все они приводят к усилению образования цитокинов и хемокинов, которые в свою очередь усиливают в тканях глаза образование свободных радикалов (СР) [8]. Повышается интенсивность окислительных реакций, что усиливает изменения в иммунной системе и ведет к усугублению окислительного стресса, то есть образуется замкнутый круг [6-8]. Происходит истощение эндогенного анти- оксидантного потенциала [9]. Выявлена корреляция между стадией течения увеита и состоянием локальных и системных антиоксидантных резервов [10]. Экспериментально доказано, что основная роль в развитии осложнений увеита (катаракта, глаукома, дегенерация сетчатки) принадлежит активации реакций свободнорадикального окисления и накоплению СР [11, 12]. Вышесказанное указывает на целесообразность применения антиоксидантов в комплексной терапии увеитов. Однако препараты антиоксидантного действия пока еще не нашли широкого применения в комплексном лечении этого заболевания глаз. В этом плане большой интерес представляет гормон Мелатонин, который обладает обширным спектром биологического действия, в том числе сильными антиоксидантными свойствами. Мелатонин является акцептором свободных радикалов как кислородного, так и азотного NO2\ а также карбонатного радикала CO3\ Мелатонин также снижает уровень высокотоксичного пероксинитрита. При этом у него есть особенность, выделяющая его из ряда других антиоксидантов, - отсутствие прооксидантных свойств даже в больших концентрациях [13]. Мелатонин способен усиливать экспрессию генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, -супероксиддисмутазу, глутатион-пе- роксидазу, глутатион-редуктазу и каталазу [14]. Он также является ингибитором циклооксигена- зы-2 и индуцибельной NO-синтазы [15] и снижает интенсивность воспаления, блокируя факторы транскрипции, активирующие экспрессию генов провоспалительных цитокинов [16]. Антиоксидантными свойствами обладают и некоторые метаболиты мелатонина. За счет их анти- оксидантная активность, проявляемая мелатонином т vivo, существенно выше таковой т vitro [17]. Имеются литературные данные о том, что мелатонин т vivo эффективнее витамина Е, Р-каротина и витамина С [17]. В экспериментальных исследованиях показано, что мелатонин играет защитную роль при таких заболеваниях глаз как кератиты, катаракта, глаукома, ретинопатия недоношенных, ишемически-ре- перфузионных повреждениях [18]. Kukner A. и соавт. установили, что инъекция мелатонина (10 мг/кг) внутрибрюшинно значительно уменьшает отек сетчатки при экспериментальном увеите у морских свинок [19]. Sande P.H. и соавт. исследовали терапевтический эффект подкожного введения микросфер с мелатонином при увеите у хомяков. Было выявлено, что мелатонин снижал ликидж белков в передний отрезок глаза, уменьшал клинические признаки воспаления. Мелатонин значительно снижал повышенный при увеите уровень активности NO- синтазы, ФНОа, нуклеарного фактора кВ [20]. Вышесказанное свидетельствует о возможности применения мелатонина для лечения увеита, однако действие мелатонина при введении в виде инстилляций не изучено. Целью работы явилось изучение влияния инстилляций мелатонина в сравнении с инстилляциями дексаметазона, а также их совместного применения на характер клинического течения и на локальные метаболические процессы во влаге передней камеры при экспериментальном увеите у кроликов. Материал и методы. Работа выполнена на 20 кроликах (40 глаз) породы шиншилла, самцах, массой 2 кг. Была использована модель иммуно- генного увеита, для постановки которой вначале проводится первичная сенсибилизация организма путем подкожного введения 5 мл нормальной лошадиной сыворотки, а затем последующее через 10 дней интравитриальное введение 0,070 мл разрешающей дозы антигена [21]. В качестве местной анестезии использовали Алкаин (0,5% прок- симетакаин). Животные были разделены на 5 групп (по 8 глаз в группе). Животные 1-й группы получали инстилляции 0,1% раствора мелатонина в фосфатном буфере рН 7,4 с ДМСО (Sigma-Aldrich; ЕС № 200-797-7); 2-й - инстилляции 0,4% раство- DOI 10.18821/1993-1859-2016-11-1-27-32 ра дексаметазона (раствор для инъекций 4мг/мл; CPSCOUYI Pharmaceutical, КНР; ЛСР-006923/10 от 21.07.10); 3-й - инстилляции 0,4% раствора дек- саметазона и 0,1% раствора мелатонина с интервалом не менее 60 минут; 4-й - фосфатный буфер рН7,4 (ЕС №» 230-907-9), содержащий ДМСО в том же соотношении, что использовалось при разведении мелатонина; 5-ю группу составили здоровые животные. Инстилляции проводили 3 раза в день по 30 мкл в оба глаза в течение 7 дней, начиная со дня введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки. Клиническую оценку течения увеита проводили ежедневно на 1-е, 2-е, 3-и, 4-е и 7-е сутки путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. В условных баллах по принятой в лаборатории шкале оценивали выраженность отека и гиперемии век и бульбарной конъюнктивы, отека радужки и роговицы, количество фибрина в передней камере глаза, наличие задних синехий, интенсивность не- оваскуляризации роговицы. На 7-е сутки увеита у всех животных забирали влагу передней камеры глаза (ВПК) путем пара- центеза под местной анестезией Алкаином (0,5% проксиметакаин). Во ВПК определяли содержание лейкоцитов, затем ее центрифугировали и супернатант использовали для биохимических исследований: концентрацию общего белка определяли по методу Лоури [22]; антиокислительную активность (АОА) - по параметрам кинетики хемилю- минесценции в модельной системе гемоглобин- ^О^люминол [23]; уровень а2-макроглобулина (а2-МГ) определяли спектрофотометрически со специфическим субстратом п-бензоил-DL- аргинин-p-нитроанилид (БАПНА) [24]; лейкоциты определяли микроскопически. Для контроля действия внешних факторов на биохимические показатели исследовали ВПК у здоровых животных. Повторный забор водянистой влаги у одного и того же животного не проводили. Величину оптической плотности образцов измеряли на микропланшетном фотометре Synergy MX (Bio-Tek, США). Кинетику хемилюминесцен- ции регистрировали на хемилюминометре “Био- токс-7” (НПО “Энергия”). Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов программ Excel и Statis- tica. Достоверность различий между группами с уровнем значимости не менее 95% оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюден- та. Для оценки различий между группами по клиническим признакам увеита был применен непараметрический ^-критерий Манна-Уитни. Результаты. После интравитреального введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки у животных наблюдалась характерная клиническая картина острого увеита. Нами выявлено, что инстилляции одного мелатонина, а также совместно с дексаметазоном снизили остроту воспалительного процесса у кроликов. По действию на отек DOI 10.18821/1993-1859-2016-11-1-27-32 Рис. 2. Влияние инстилляций мелатонина, дексаметазона, а также их сочетания на уровень АОА во влаге передней камеры на 8-е сутки экспериментального увеита у кроликов. По оси абсцисс - группы экспериментальных животных; по оси ординат - значение в процентах от здоровых животных. век лечение инстилляциями дексаметазона было сопоставимо с применением инстилляций мелатонина (рис. 1, а, см. вклейку). Наблюдался синергический эффект дексаметазона и мелатонина на протяжении всего периода наблюдения (р < 0,05). Гиперемию конъюнктивы инстилляции дексаме- тазона снижали несколько лучше, чем инстилляции мелатонина (рис. 1, б, см. вклейку). Также наблюдался синергический эффект от совместного применения двух препаратов на протяжении всего периода наблюдения. Под действием мелатонина отек роговицы нарастал медленнее, но с 3-х по 7-е сутки инстилляции дексаметазона более эффективно снижали отек роговицы, чем мелатонина (р < 0,05). Наблюдался синергический эффект от совместного применения мелатонина и дексаметазона на протяжении острого периода воспаления (рис. 1, в, см. вклейку), тогда как на 7-е сутки эффект от лечения дексаметазоном был сопоставим с эффектом совместного применения двух препаратов (р < 0,05). Наблюдалось невыраженное синергическое действие мелатонина и дексаметазона в отношении отека радужки (р < 0,05). Применение инстилляций одного дексаметазона было сопоставимо с применением инстилляций мелатонина (рис. 1, г, см. вклейку). На протяжении всего периода наблюдения замечено, что инстилляции дексаметазона лучше снижали содержание фибрина в ВПК, чем мелатонин. Совместное применение инстилляций двух препаратов было сопоставимо с лечением инстилляциями одного дексаметазона (рис. 1, д cм. вклейку). Интенсивность неоваскуляризации роговицы была менее выражена у животных, получавших дексаметазон. Совместное применение инстилляций двух препаратов было сопоставимо с лечением инстилляциями одного дексаметазона (рис. 1, е, см. вклейку). Анализ биохимических параметров в ВПК показал, что на 8-е сутки у всех животных с увеи- том АОА была значительно ниже нормы. В группе животных, получавших инстилляции плацебо, она была снижена в 18 раз по сравнению с нормой, лечение мелатонином вызвало повышение АОА почти в 3 раза по сравнению с животными, получавшими инстилляции плацебо (р < 0,05), тогда как лечение дексаметазоном повысило АОА в 1,8 раза по сравнению с животными, получавшими 30 инстилляции плацебо (р < 0,05). Сочетание препаратов дало повышение АОА в 2,2 раза по сравнению с инстилляциями плацебо (р < 0,05). На 8-е сутки воспалительного процесса концентрация общего белка в ВПК у нелеченных животных превышала норму примерно в 10 раз (р < 0,05). У животных, получавших мелатонин, концентрация общего белка в ВПК превышала норму в 7,7 раза (р < 0,05), а дексаметазон - в 5,4 раза (р < 0,05). У животных, леченных сочетанием препаратов, концентрация белка в ВПК превышала норму в 7 раз (р < 0,05). Нами было отмечено, что на 8-е сутки экспериментального увеита уровень а2-МГ в ВПК у нелеченных животных был в 5 раз выше нормы (р < 0,05), у животных, леченных мелатонином - выше нормы в 4,3 раза (р < 0,05), дексаметазоном - в 2,5 раза (р < 0,05), сочетанием препаратов - в 4,6 раза (р < 0,05). У нелеченных животных на 8-е сутки увеита количество лейкоцитов во влаге передней камеры было в 12,5 раз больше, чем у здоровых животных (р < 0,05). Инстилляции мелатонина у леченных животных снизили количество лейкоцитов в 2,2 раза по сравнению с нелеченными (р < 0,05), тогда как инстилляции дексаметазона - в 1,8 (р < 0,05). Обсуждение. Инстилляции мелатонина при остром увеите у кроликов в такой же степени, как и инстилляции дексаметазона уменьшают отек век и радужки. Наблюдается синергический эффект при совместном применении этих препаратов в отношении отека век, гиперемии конъюнктивы, отека роговицы и радужки. Значительное снижение АОА в ВПК у животных с увеитом на 8-е сутки, свидетельствует о развитии выраженного окислительного стресса при данном заболевании. Лечение инстилляциями мелатонином вызвало большее повышение АОА, чем лечение дексаметазоном. Лечение сочетанием препаратов дало промежуточное повышение АОА. Таким образом, применение инстилляций мелатонина позволило повысить антиокислительный потенциал дексаметазона (рис. 2). Повышение концентрации общего белка в ВПК у животных на 8-е сутки воспалительного процесса отражает выраженное нарушение гематооф- тальмического барьера и говорит о повышенной проницаемости сосудов. Лечение инстилляциями дексаметазона, также как и мелатонина снижало содержание общего белка в ВПК. Дексаметазон больше снижал содержание белка в ВПК, по сравнению с мелатонином, а сочетание их не усиливало эффекта. Известно, что содержание а2-МГ возрастает в острый период воспаления. Этот белок является, во-первых, ингибитором сериновых протеаз, которые во множестве активируются при воспалении, а во-вторых, переносчиком ряда факторов иммунной системы [25], что важно при данной модели увеи- та. Лечение инстилляциями дексаметазона, также как и мелатонина снижало уровень а2-МГ в ВПК. В данном случае дексаметазон лучше снижал уровень а2-МГ, чем мелатонин, а сочетание двух препаратов не давало синергического эффекта. Повышение количества лейкоцитов в ВПК у животных на 8-е сутки увеита также отражает степень остроты воспалительного процесса. Противовоспалительный эффект мелатонина по этому показателю оказался незначительно выше, чем у дексаметазона. По этому показателю синергического действия мелатонина и дексаметазона при совместном применении двух препаратов отмечено не было. Заключение Включение местного применения 0,1% раствора мелатонина в виде глазных капель в комплексную терапию увеитов может позволить повысить эффективность лечения данного заболевания. Лечение мелатонином способствует уменьшению выраженности клинических признаков воспаления. Результаты биохимического исследования влаги передней камеры на 8-е сутки воспаления свидетельствуют об увеличении местного анти- окислительного потенциала и уменьшении проницаемости гематоофтальмического барьера под влиянием лечения мелатонина. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Конфликт интересов отсутствует. Долевое участие авторов: концепция и дизайн исследования - H. Б. Чеснокова; сбор и обработка материала - О.В. Безнос, Г.А. Бейшенова; статистическая обработка - О.В. Безнос; написание текста - Г.А. Бейшенова; редактирование - Н.Б. Чеснокова.

About the authors

N. B Chesnokova

The Helmholtz Moscow Research Institute of Eye Diseases

Moscow, 105062, Russian Federation

O. V Beznos

The Helmholtz Moscow Research Institute of Eye Diseases

Moscow, 105062, Russian Federation

Gulmira Alimovna Beyshenova

The Helmholtz Moscow Research Institute of Eye Diseases

Email: tagaeva08@yandex.ru
post-graduate student, Department of Retinal and Optic Nerve Pathology Moscow, 105062, Russian Federation

References

Supplementary files