PECULIAR FEATURES OF PROTEIN COMPOSITION OF THE LACRIMAL FLUID IN CHILDRENAND ADOLESCENTS WITH HIGH PROGRESSIVE MYOPIA

Full Text

Согласно современным представлениям, одним из ведущих патогенетических факторов возникно- вения и прогрессирования миопии, сопровождаю- щегося удлинением глазного яблока в передне-заднем направлении, является растяжение и осла- бление склеральной оболочки глаза, связанное с развитием в ее соединительной ткани дистрофиче- ского процесса [1—4]. Углубленные морфологические и биохимические исследования изолированной склеры глаз с близо- рукостью высокой степени выявили существенные нарушения ее экстрацеллюлярных соединитель- нотканных структур, прежде всего связанные с из- менениями в обмене белков, в частности, коллагена [1, 2, 5—7]. Однако прижизненная оценка белково- го обмена, в том числе обмена коллагена и других компонентов соединительнотканного матрикса, у пациентов с миопией проводилась только на систем- ном уровне [8—12]. В частности, было установлено увеличение экскреции оксипролина — маркерной аминокислоты коллагена и гликозаминогликанов (ГАГ) — основного компонента межуточной суб- станции соединительной ткани, а также повышение в сыворотке крови детей и подростков с прогресси- рующей миопией уровня свободного оксипролина и активности гиалуронидазы — лизосомального фер- мента, расщепляющего ГАГ [2, 8]. В последние годы для оценки локальных биохи- мических изменений обмена веществ в тканях глаза используют слезную жидкость (СЖ) как наиболее доступный биологический объект, в определенной степени отражающий метаболические процессы, происходящие в глазу в норме и при патологии [13— 17]. Выявление корреляции биохимического состава слезы с наличием и выраженностью изучаемой оф- тальмопатологии может расширить представление о ее патогенезе и помочь в диагностике, оценке про- гноза и выборе патогенетически ориентированной терапии. Вместе с тем, работ, посвященных изучению бел- кового состава СЖ при прогрессирующей миопии, в доступной литературе мы не встретили. Целью настоящей работы является изучение особенностей белкового состава СЖ детей и подрост- ков с высокой прогрессирующей миопией. Материал и методы. Объектом исследования являлись 35 образцов СЖ, взятых у 35 детей и под- ростков (20 девочек, 15 мальчиков) в возрасте от 10 до 17 лет (средний возраст М ± σ: 13,1 ± 2,2 лет) с миопией от 5,0 до 20,5 дптр (в среднем М ± σ: 9,5 ± 3,7 дптр) и средним градиентом прогрессирования М ± σ: 0,98 ± 0,8 дптр/год, из них у 19 детей выявлены различные формы периферических витреохориоретинальных дистрофий. Все включенные в исследование пациенты не пользовались для коррекции миопии контактными линзами. Группу контроля составили образцы СЖ 9 детей и подростков с эмметропией (6 девочек, 3 мальчика) в возрасте 10—13 лет (средний возраст М ± σ: 12,4 ± 0,5 лет) без изменений на глазном дне. СЖ набирали в утренние часы после раздражения слизистой носа с помощью ингаляции 10% раствора гидроксида аммония из нижнего конъюнктивального свода одного глаза микрокапилляром в объеме 100 мкл и помещали в сухую герметичную пробирку. Сразу после забора пробы СЖ замораживали при температуре -18oC. Как показано в работе R. Fullard и C. Snyder [18], содержание некоторых белков в СЖ, в том числе лактоферрина и лизоцима, уровень которых оценивался в данной работе, не зависит от метода ее получения (стимулированная и нестимулированная СЖ). 28 В пробах СЖ определяли содержание общего белка по методу М.М. Bradford [19]. Качественное определение белкового состава и содержания бел- ков в СЖ проводилось методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), поскольку он считается одним из наиболее экономичных и до- ступных методов для решения этой задачи [20]. В данной работе белки проб СЖ разделяли с по- мощью одномерного гель-электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и окрашивали раствором Ку- масси. Количественное определение содержания лактоферрина и лизоцима проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с ис- пользованием двух различных первичных антител к изучаемым белкам, так называемый «сэндвич- метод» (ELISA) [21]. На твердой фазе были иммо- билизованы аффинно-очищенные поликлональные антитела к лизоциму — sheep anti-human Lysozyme (Serotec) и моноклональные антитела к лактоферри- ну — mouse anti-human Lactoferrin (Serotec). Парами к этим антителам были выбраны антитела кролика к лизоциму человека (GenWay) и антитела кролика к лактоферрину человека (GenWay). В качестве вто- ричных антител к иммуноглобулинам кролика бы- ли использованы афинно-очищенные козлиные ан- титела к тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов кролика класса Ig, конъюгированные с пероксида- зой хрена (Blotting Grade Affinity Purified Goat anti Rabbit IgG (H+L) Horseradish Peroxidase Conjugate (Bio Rad)). В качестве субстрата для ферментатив- ной цветной реакции применяли тетраметилбензи- дин. Абсорбционность измеряли на спектрофото- метре Star Fax 2100 при длине волны поглощения 450 нм и дифференциальной длине волны 630 нм. Для построения калибровочных кривых использо- вали рекомбинантные лизоцим и лактоферрин че- ловека (USBiological). Статистический анализ полученных данных про- веден с помощью программы Microsoft Excel и паке- та статистических программ STATISTICA 6.0. Рас- считывали медианы и оценивали диапазон с 50% всех значений (квартили — 25% и 75%). Значимость различий средних величин количественных призна- ков оценивалась непараметрическими методами по U-критерию Манна—Уитни для двух независимых групп. Различия считались достоверными в случае р < 0,05. Результаты и обсуждение. На первом этапе про- водилось определение общей концентрации белка в СЖ пациентов с различной рефракцией, которое по- казало, что при высокой миопии этот показатель до- стоверно ниже, чем при эмметропии (рис. 1): 5,65 (4,85; 6,333) мг/мл и 7,66 (6,83; 8,16) мг/мл соответ- ственно (р = 0,000408). В связи с этим необходимо было определить, явля- ется ли обнаруженное снижение общей концентрации белка следствием общей депрессии синтетической активности или отражает снижение концентрации каких-либо отдельных белковых компонентов слезы при миопии высокой степени? Качественное определение содержания белков в СЖ методом SDS-электрофореза в ПААГ показало, что основными белками СЖ являются лизоцим, лак- тоферрин, липокалин (они составляют 70—85% всех Российская педиатрическая офтальмология, №2, 2013 Т аб лица 1 Отношение содержания лактоферрина (Ltf) к лизоциму (Lys), а также отношение содержания этих белков к общему содержанию белка (ТРС) в СЖ детей и подростков с прогрес- сирующей миопией высокой степени и эмметропией (контрольная группа), мг/мл П р и м е ч а н и е. * — различие показателей достоверно. Рис. 1. Содержание основных белков (лактоферрина и лизоцима), а также общего белка (мг/мл) в СЖ детей и подростков с эмметропией (контрольная группа) и про- грессирующей миопией высокой степени. секретируемых белков), а также трансферрин и секре- торный IgA [20]. При разделении этим методом бел- ков СЖ обследованных нами пациентов с эмметропи- ей и миопией высокой степени мы обнаружили, что мажорным белкам соответствуют полосы на уровне ~80 кДа и 19 кДа, в которых, согласно литературным данным, находятся лактоферрин и лизоцим [22]. Для более точного количественного определения содержания данных белков в СЖ далее использовал- ся метод ELISА. Полученные результаты представ- лены на рис. 1. Как видно из данных, представленных на рис. 1, при миопии высокой степени концентрация лизоцима оказалась несколько сниженной по сравнению с эм- метропией — 1,15 (0,9; 1,36) мг/мл и 1,55 (1,20; 1,97) мг/мл соответственно. Концентрация лактоферрина, наоборот, при миопии высокой степени была несколь- ко выше, чем при эмметропии, — 2,04 (1,77; 2,56) мг/ мл и 1,79 (1,56; 2,25) мг/мл соответственно. Однако для обоих белков эти изменения не были статистиче- скими достоверными, p = 0,08 (на уровне тенденции статистической значимости) для лизоцима и p = 0,26 для лактоферрина (р > 0,05). Таким образом, изменения в концентрации лизо- цима и в общей концентрации белка характеризуются одной и той же тенденцией: наблюдается их сниже- ние при миопии высокой степени. При этом доля ли- зоцима в общей концентрации белка (лизоцим/общий белок) остается постоянной и составляет 0,19 (0,16; 0,25) мг/мл при миопии высокой степени и 0,19 (0,17; 0,25) мг/мл при эмметропии (табл. 1). Как было отмечено выше, концентрация лактоферрина при прогрессирующей миопии высокой степени оказалась несколько повышенной (см. рис. 1). Поскольку общая концентрация белка снижена, доля лактоферрина в общей концентрации белка при миопии высокой степени оказалась существенно (в 1,6 раза) выше, чем при эмметропии (в контрольной группе) — 0,23 (0,2; 0,29) и 0,37 (0,33; 0,43) мг/мл соответственно), различие высоко достоверно (р = 0,000185). При этом, как показывают данные табл. 1, соотношение содержания в СЖ лактоферрина и лизоцима при вы- сокой миопии также достоверно выше (в 1,7 раза), чем у пациентов с эмметропией (р = 0,006754), не- смотря на значительный индивидуальный разброс уровня этих белков в обеих группах. Полученные результаты позволяют сделать вы- вод о том, что характер изменений уровня лизоцима совпадает с изменениями общей концентрации бел- ка и, вероятно, связан со снижением при прогресси- рующей миопии синтетической активности белков соединительной ткани. В то же время изменения в концентрации лактоферрина носят противополож- ный характер и, вероятно, объясняются другими причинами. Для выявления возможной связи между снижени- ем содержания общего белка и лизоцима, а также по- вышением относительной доли лактоферрина в СЖ в развитии миопических осложнений, данные показа- тели были определены отдельно у детей и подростков с различным характером течения миопического про- цесса (осложненным и неосложненным). Получен- ные данные представлены на рис. 2 и в табл. 2. Полученные результаты не выявили значимых различий: при осложненной миопии высокой сте- Рис. 2. Концентрация лактоферрина и лизоцима (мг/мл), а также общее содержание белка в СЖ детей и подрост- ков с осложненной и неосложненной миопией высокой степени. 29 Российская педиатрическая офтальмология, №2, 2013 Т аб лица 2 Отношение содержания лактоферрина (Ltf) к лизоциму (Lys), а также отношение содержания этих белков к общему содержанию белка (ТРС) в СЖ детей и подростков с ослож- ненной и неосложненной прогрессирующей миопией высо- кой степени, мг/мл (медиана, квартили) Показатель Миопия p Показатель осложненная неосложненная p Ltf/TPC 0,38 (0,32; 0,42) 0,37 (0,33; 0,45) 0,816699 Lys/ТРС 0,21 (0,18; 0,24) 0,18 (0,12; 0,26) 0,425031 Ltf/Lys 1,79 (1,54; 2,25) 2,19 (1,44; 2,96) 0,382284 пени концентрация лизоцима в СЖ составила 1,15 (1,06; 1,33) мг/мл, при неосложненной — 1,11 (0,59; 1,53) мг/мл, концентрация лактоферрина при ослож- ненной — 2,16 (1,6; 2,56) мг/мл, при неосложненной несколько (недостоверно) ниже — 1,96 (1,83; 2,54) мг/мл. Уровень общего белка также практически не различался у обследованных детей с различным те- чением миопического процесса, а доля лактоферрина (показатель Ltf/TPC) составила соответственно 0,38 (0,32; 0,42) и 0,37 (0,33; 0,45) мг/мл. Таким образом, можно заключить, что выявленные особенности бел- кового состава СЖ в основном связаны с процессом прогрессирования миопии и не отражают впрямую наличие дистрофических изменений сетчатки миопи- ческого генеза. Можно предположить, что впервые выявленное снижение в СЖ содержания общего белка и одного из мажорных белков СЖ — лизоцима (при посто- янстве его относительной доли) при миопии высо- кой степени является следствием общей депрессии синтетической активности протеинов в период про- грессирования миопии. Известно, что кроме своей антибактериальной функции, лизоцим также прини- мает участие в защитных иммунных реакциях, а так- же в процессах регенерации и заживления ран [16]. В связи с этим в пользу высказанного предположе- ния говорят имеющиеся данные о снижении уровня биосинтеза основного соединительнотканного белка (коллагена) в миопической склере и об увеличении доли его растворимой фракции при одновременном снижении доли нерастворимого коллагена, т. е. о преобладании процессов катаболизма этого белка над его синтезом [2, 8]. Показано также, что у боль- ных с прогрессирующей миопией активность проте- аз в СЖ достоверно выше нормы — на 59,1% и на 34,6% выше, чем у больных с косоглазием (p < 0,01 в обоих случаях), а также достоверно снижена анти- протеолитическая активность (на 30,6% в сравнении с таким показателем у здоровых лиц, р < 0,05) [11], что является признаком нарушения белкового обме- на при прогрессирующей миопии, проявляющегося на уровне СЖ. В то же время установленное нами повышение относительной доли лактоферрина (как по отноше- нию к общему содержанию белка в СЖ, так и по отношению к уровню лизоцима), очевидно, отража- ет другие процессы, связанные с прогрессировани- ем миопии. Как известно, лактоферрин — железо- содержащий гликопротеид, обладает множеством разнообразных функций, основными из которых 30 являются антибактериальная, противовоспалитель- ная, антиоксидантная и металлохелатная [23, 24]. Последние две представляют большой интерес для данного исследования, поскольку ранее было по- казано, что в СЖ при прогрессирующей миопии меняются показатели, характеризующие состояние антиокислительной системы, а также увеличивается содержание железа, обладающего прооксидантным действием [2]. При развитии патологических изме- нений глазного дна, связанных с прогрессирующей миопией, активизируются процессы перекисного окисления липидов при одновременном ослабле- нии антиокислительной защитной системы, как на уровне организма, так и непосредственно в органе зрения. Продукты свободнорадикального окисле- ния и активные формы кислорода оказывают по- вреждающее действие на соединительнотканные и другие структуры оболочек глаза [13, 25], что явля- ется существенным фактором прогрессирующего и осложненного течения миопии. Учитывая то, что доля лактоферрина в суммарном белковом соста- ве СЖ значительна, его антиоксидантное действие может вносить существенный вклад в общую анти- окислительную активность сред и тканей глаза и тем самым препятствовать развитию миопического процесса. Повышение концентрации лактоферрина в СЖ при миопии высокой степени может свиде- тельствовать о компенсаторной реакции организма, направленной на борьбу с активацией окислитель- ных процессов, происходящих при прогрессирова- нии заболевания. Если принять это предположение, то можно рассматривать повышение относительной доли лактоферрина в СЖ как диагностический при- знак, свидетельствующий о прогрессирующем ха- рактере течения миопии. Заключение Проведенное сравнительное изучение белкового состава СЖ у детей и подростков с прогрессирующей миопией высокой степени и эмметропией позволи- ло выявить определенные отличия, характерные для изучаемой офтальмопатологии, а именно достовер- ное снижение при миопии общего содержания бел- ка и одновременное повышение доли лактоферрина, одного из мажорных протеинов СЖ, обладающего среди других функций антиоксидантным и металло- хелатным действием. Полученные данные, с одной стороны, подтверждают патогенетическую роль на- рушения антиоксидантной защитной системы сред и тканей глаза в развитии миопического процесса, а с другой — позволяют рассматривать снижение со- держания общего белка и повышение относительной доли лактоферрина в СЖ как возможные диагности- ческие признаки прогрессирующего характера мио- пического процесса.

About the authors

Elena Naumovna Iomdina

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: iomdina@mail.ru
105062, Moscow, Russian Federation

Elena Petrovna Tarutta

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: elenatarutta@mail.ru
105062, Moscow, Russian Federation

Irina Mihajlovna Kuryleva

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: imkuryleva@gmail.com
105062, Moscow, Russian Federation

Yuliya Mihajlovna Aksenova

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases Ministry of Health of the Russian Federation

Email: dr.aksyonova.yuliya@gmail.com
105062, Moscow, Russian Federation

Elena Anatol'evna Surina

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: surinae@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Irina Vladimirovna Smirnova

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: smirnova@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Anna Pajzenovna Bogachuk

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: apbog@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

Valerij Mihajlovich Lipkin

Federal state budgetary institution of science «Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry» Russian Academy of Sciences

Email: vmlipkin@mx.ibch.ru
117997, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files