RAZRABOTKA SELEKTIVNOY DOBAVKI K PITATATEL'NOY SREDE DRIGALSKI LACTOSE AGAR

Abstract


Цель исследований - совершенствование селективной добавки к элективным средам для выделения энтеробактерий. Задачи исследований - выявить чувствительность выделенных штаммов энтеробактерий к антибиотикам; разработать новую селективную добавку с антибиотиками к питательной среде DrigalskiLactose Agar. Среды должны иметь рецептуру, оптимально обеспечивающую рост и размножение микроорганизмов определённого вида или семейства. Интенсивное развитие биотехнологии и микробиологии позволяет сегодня разрабатывать новые питательные среды и модифицировать уже имеющиеся рецептуры сред. Объект исследования - новая селективная добавка с антибиотиками к питательной среде DrigalskiLactose Agar. Материал для исследований - 253 изолята бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Исследование проводили в период с 2010 по 2017 гг. Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин 30±2,3 из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин 37±2,5 из группы уреидопенициллинов, канамицин 24±1,5, амикацин 26±1,7 и гентамицин 25±0,8, цефепим 38±3,2 из группы цефалоспоринов IV поколения, тетрациклин 28±1,6, доксициклин 34±2,3 и хлорамфеникол 31±2,5, налидиксовая кислота 37±2,8, триметоприм 35±3,4. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов, к стрептомицину, цефалотину из группы цефалоспоринов I поколения, к полимиксину В, к офлоксацину (таривид) и метронидазолу. В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Были выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид, из группы кетолидов телитромицин. В состав разработанной селективной добавки к среде Drigalski Lactose Agar введены антибиотики ванкомицин и телитромицин в дозе 0,008 г/дм3, линезолид 0,004 г/дм3 среды.

Full Text

Совершенствование средств оценки показателей микробиоценоза животных, диагностики, профилактики, лечения незаразных и инфекционных болезней является наиболее значимой задачей, стоящей на сегодняшний день перед ветеринарными специалистами, микробиологами и биотехнологами. Одним из важных элементов в лабораторной диагностике инфекционных болезней является выделение возбудителя в чистой культуре на питательных средах [6, 7, 8]. Среды должны иметь рецептуру, оптимально обеспечивающую рост и размножение микроорганизмов определённого вида или семейства. Интенсивное развитие биотехнологии и микробиологии позволяет сегодня разрабатывать новые питательные среды и модифицировать уже имеющиеся рецептуры сред [1, 2, 3, 4, 5]. В связи с этим, конструирование и производство качественных питательных сред, разработка рецептур новых микробиологических сред и совершенствование уже применяемых сред - одно из важных направлений работы в области биотехнологии, медицинской и ветеринарной микробиологии [6, 7, 8, 9]. Цель исследований - совершенствование селективной добавки к элективным средам для выделения энтеробактерий. Задачи исследований - выявить чувствительность выделенных штаммов энтеробактерий к антибиотикам; разработать новую селективную добавку с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar. Материал и методы исследования. Объект исследований - новая селективная добавка с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar. Материал для исследований - 253 изолята бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Исследования проводили в период с 2010 по 2017 гг. Суспензию биоматериала для получения роста культур энтеробактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию материала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С, 370С 48-72 ч [10]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Количество выросших колоний микроорганизмов (КОЕ - колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий). Определение чувствительности выделенных нами от различных животных изолятов энтерорбактеий к антимикробным препаратам проводили диско-диффузионным методом на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтона. Подбор антибиотиков и создание селективной добавки с антибиотиками к среде Drigalski Lactose Agar осуществляли методом серийных разведений в бульоне МПБ и на Эндо агаре. Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Результаты исследований. В процессе разработки новой селективной добавки к питательной среде Drigalski Lactose Agar выявлялась чувствительность энтеробактерий к антимикробным препаратам. Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к пенициллинам (ампициллин № 1, бензилпенициллин № 2, амоксициллин № 3, карбенициллин № 4 и пиперациллин № 5) и аминогликозидам посредством постановки диско-диффузионного теста представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1 Антибиотикочувствительность энтеробактерий к пенициллинам Чистая культура энтеробактерий Пенициллины (значение зоны ингибиции роста (мм)) № 1 № 2 № 3 № 4 № 4 Escherichia coli 16±0,2 8±0,1 17±0,4 22±0,5 21±0,6 Shigella dysenteriae 18±0,4 3±0,07 18±0,6 23±0,8 22±0,5 Shigella flexneri 19±0,6 2±0,05 19±0,7 25±0,5 21±0,9 Salmonella Enteritidis 18±0,4 3±0,06 17±0,9 24±0,7 23±0,8 Klebsiella oxytoca 20±1,6 3±0,04 21±0,8 24±0,9 25±0,7 Proteus vulgaris 17±1,3 0,7±0,08 20±1,2 26±1,6 28±1,4 Providencia alcalifaciens 15±0,4 1±0,04 18±1,4 22±1,8 20±1,2 Hafnia alvei 20±1,8 0,4±0,3 19±1,5 25±1,8 28±1,7 Morganella morganii 18±2,5 0,5±0,06 20±1,3 23±1,6 27±1,5 Enterobacter cloacae 22±1,5 0,8±0,2 22±1,4 28±1,8 24±2,3 Citrobacter freundii 22±0,8 4±0,1 21±1,2 25±1,6 33±2,2 Serratia marcescens 18±0,4 2±0,08 17±1,5 21±1,4 23±1,8 Erwinia amylovora 24±3,8 0,4±0,05 28±1,7 30±2,3 37±2,5 Kluyvera cryocrescens 17±1,3 0,5±0,07 16±1,8 21±1,5 24±2,0 Yersinia enterocolitica 3±0,4 5±0,06 15±0,8 21±1,2 23±1,3 Таблица 2 Антибиотикочувствительность энтеробактерий к аминогликозидам Чистая культура энтеробактерий Аминогликозиды (значение зоны ингибиции роста (мм)) стрептомицин канамицин амикацин гентамицин Escherichia coli 16±0,2 17±0,1 18±0,4 15±0,3 Shigella dysenteriae 19±0,7 22±0,8 24±1,2 20±0,6 Shigella flexneri 17±0,9 24±1,5 20±1,4 22±1,3 Salmonella Enteritidis 15±0,5 19±0,6 22±1,6 18±0,2 Klebsiella oxytoca 19±1,7 23±1,5 18±0,9 25±2,3 Proteus vulgaris 17±1,6 20±1,3 17±1,3 23±2,8 Providencia alcalifaciens 18±1,2 19±0,8 26±1,7 21±2,2 Hafnia alvei 18±1,2 19±1,7 21±1,4 22±2,6 Morganella morganii 19±1,8 22±2,6 19±1,6 23±3,2 Enterobacter cloacae 19±1,4 22±1,2 23±1,7 20±1,3 Citrobacter freundii 16±0,8 17±0,9 20±0,8 19±0,5 Serratia marcescens 18±0,3 19±0,5 17±1,6 20±0,8 Erwinia amylovora 22±2,4 24±4,2 22±1,4 19±2,6 Kluyvera cryocrescens 15±1,2 19±0,7 26±1,8 22±1,6 Yersinia enterocolitica 10±0,3 23±0,7 16±1,2 25±0,8 Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин из группы уреидопенициллинов, канамицин, амикацин и гентамицин. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов и к стрептомицину. Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к цефалоспоринам (цефалотин № 1, цефтриаксон (лонгацеф) № 2, цефотаксим (клафоран) № 3, цефепим № 4, цефозопран № 5 и цефквин № 6) в результате постановки диско-диффузионного теста представлены в таблице 3. Результаты определения чувствительности энтеробактерий к к тетрациклину представлены в таблице 4. Таблица 3 Антибиотикочувствительность энтеробактерий к цефалоспоринам Чистая культура энтеробактерий Цефалоспорины (значение зоны ингибиции роста (мм)) № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 Escherichia coli 10±0,5 21±1,2 23±1,7 25±1,9 23±1,6 22±1,5 Shigella dysenteriae 12±0,8 16±1,5 18±0,9 23±2,2 21±1,2 20±1,2 Shigella flexneri 10±1,3 17±0,9 19±1,8 24±1,4 20±1,3 19±0,7 Salmonella Enteritidis 12±0,9 18±1,7 18±0,6 26±1,7 18±0,9 18±0,5 Klebsiella oxytoca 8±0,5 20±1,9 17±1,3 32±2,3 25±1,7 23±1,9 Proteus vulgaris 10±1,5 17±0,7 22±2,5 26±1,2 22±1,2 21±2,3 Providencia alcalifaciens 12±0,7 22±1,2 21±2,2 28±1,9 19±0,7 20±0,7 Hafnia alvei 10±0,5 23±2,3 23±1,5 30±1,6 23±1,4 22±1,8 Morganella morganii 11±0,6 21±1,8 20±0,7 34±2,3 26±1,7 28±2,2 Enterobacter cloacae 10±0,4 20±2,4 17±0,4 33±2,6 22±1,2 24±1,6 Citrobacter freundii 13±1,7 18±0,8 16±0,9 30±1,8 19±1,9 25±2,4 Serratia marcescens 12±0,8 16±0,5 19±1,2 38±3,2 26±1,3 30±3,4 Erwinia amylovora 10±0,5 21±0,9 21±1,8 37±2,8 27±1,4 31±2,6 Kluyvera cryocrescens 8±0,3 20±1,3 23±2,5 31±2,6 22±2,3 26±1,8 Yersinia enterocolitica 10±0,7 15±0,6 20±1,7 27±1,8 20±1,8 22±1,5 Таблица 4 Антибиотикочувствительность энтеробактерий Чистая культура энтеробактерий Антибиотики (значение зоны ингибиции роста (мм)) тетрациклин доксициклин полимиксин В хлорамфеникол Escherichia coli 17±0,3 16±0,8 18±1,5 18±0,7 Shigella dysenteriae 19±1,2 18±0,5 10±0,3 25±2,3 Shigella flexneri 20±1,6 15±0,4 12±0,8 20±2,6 Salmonella Enteritidis 18±0,9 14±0,7 10±0,6 22±1,8 Klebsiella oxytoca 24±1,8 13±0,9 19±1,3 31±2,5 Proteus vulgaris 27±2,2 16±0,5 8±0,5 26±2,5 Providencia alcalifaciens 22±1,4 20±1,2 10±1,8 20±2,3 Hafnia alvei 20±0,8 18±0,7 12±1,2 23±1,4 Morganella morganii 18±1,5 24±1,6 8±0,3 22±2,4 Enterobacter cloacae 19±0,7 26±2,4 10±1,6 21±1,3 Citrobacter freundii 25±2,3 28±2,7 18±1,4 19±1,5 Serratia marcescens 28±1,6 16±1,3 12±1,2 23±1,6 Erwinia amylovora 22±1,5 22±2,6 13±0,8 26±3,6 Kluyvera cryocrescens 20±1,3 18±0,5 14±0,9 25±1,8 Yersinia enterocolitica 10±0,5 34±2,3 13±1,5 27±2,7 Наибольшую антимикробную активность в отношении энтеробактерий проявляли цефепим, тетрациклин, доксициклин и хлорамфеникол. Наибольшая устойчивость энтеробактерии выявлена к цефалотину и к полимиксину В. Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к хинолонам (налидиксовая кислота (невиграмон) № 1, офлоксацин (таривид) № 2 и ципрофлоксацин № 3) представлены в таблице 5. Чувствительность энтеробактерий к метронидазолу № 1, фурадонину № 2, ко-тримоксазолу № 3 и триметоприму № 4 приведена в таблице 6. Наибольшую антимикробную активность в отношении энтеробактерий проявляла налидиксовая кислота и триметоприм. Относительно хорошая устойчивость у большинства энтеробактерии выявлена к офлоксацину (таривид) и метронидазолу. В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Были выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид, а из группы кетолидов телитромицин. Таблица 5 Антибиотикочувствительность энтеробактерий к хинолонам Чистая культура энтеробактерий Хинолоны (значение зоны ингибиции роста (мм)) № 1 № 2 № 3 Escherichia coli 28±2,2 15±1,6 26±1,8 Shigella dysenteriae 20±1,3 16±0,8 23±1,5 Shigella flexneri 24±1,8 20±1,5 23±2,5 Salmonella Enteritidis 27±1,5 22±1,8 19±1,2 Klebsiella oxytoca 33±2,4 18±0,7 25±1,6 Proteus vulgaris 22±2,8 15±0,5 20±1,5 Providencia alcalifaciens 20±1,2 20±2,4 24±0,8 Hafnia alvei 28±3,4 24±3,2 20±0,6 Morganella morganii 20±3,8 17±0,5 29±1,4 Enterobacter cloacae 26±2,6 23±2,5 19±0,5 Citrobacter freundii 21±1,2 28±2,7 18±0,7 Serratia marcescens 24±1,7 16±2,2 22±1,8 Erwinia amylovora 33±3,6 19±1,6 20±1,3 Kluyvera cryocrescens 23±1,5 26±1,8 21±0,5 Yersinia enterocolitica 37±2,8 20±1,2 45±3,6 Таблица 6 Антибиотикочувствительность энтеробактерий Чистая культура энтеробактерий Антибиотики (значение зоны ингибиции роста (мм)) № 1 № 2 № 3 № 4 Escherichia coli 8±0,8 18±1,2 17±0,5 26±2,3 Shigella dysenteriae 6±0,5 22±1,9 20±1,2 28±2,8 Shigella flexneri 5±0,4 26±2,2 25±1,5 30±2,6 Salmonella Enteritidis 8±1,4 15±0,8 20±1,6 22±1,8 Klebsiella oxytoca 10±1,6 8±1,8 25±3,2 24±1,5 Proteus vulgaris 12±1,8 12±1,3 25±3,8 28±2,5 Providencia alcalifaciens 8±0,8 20±1,4 25±2,6 25±1,8 Hafnia alvei 10±1,2 18±2,2 23±2,5 23±2,0 Morganella morganii 12±1,5 10±3,5 27±4,5 26±1,7 Enterobacter cloacae 10±1,4 8±1,4 26±1,9 27±2,2 Citrobacter freundii 8±0,5 20±1,6 25±1,5 30±2,4 Serratia marcescens 8±1,2 19±0,6 22±0,7 35±3,4 Erwinia amylovora 10±2,2 12±1,3 37±6,2 34±2,6 Kluyvera cryocrescens 12±2,6 18±1,2 21±0,9 32±3,6 Yersinia enterocolitica 10±1,5 28±0,6 21±0,7 30±2,7 Ванкомицин является антибиотиком, ингибирующим биосинтез клеточной стенки бактерий, блокируя синтез пептидогликана. Ванкомицин проявляет активность в отношении большинства грамположительных микроорганизмов, особенно в отношении Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterococcus spp., в том числе проявляющих устойчивость к антибактериальным препаратам других групп. Устойчивой резистентности к ванкомицину у грамположительных микроорганизмов не выявлено, за исключением единичных клинических случаев. Ванкомицин не имеет перекрёстной резистентности с другими антибиотиками. Линезолид ингибирует биосинтез микробного белка по принципиально новому механизму действия, чем существенно превосходит по эффективности макролиды, линкозамиды, хлорамфеникол, тетрациклины и аминогликозиды. Линезолид высоко активен в отношении полирезистентных Staphylococcus spp. и Enterococcus spp., а также в отношении Streptococcus pneumonia, Bacillus spp., Corynebacterium spp., Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis и Rhodococcus spp., Clostridium perfringens, C. difficile, Peptostreptococcus spp., Bacteroides fragilis. К линезолиду проявляют чувствительность и грамотрицательные бактерии Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Legionella spp., Bordetella pertussis и B. parapertussis. Линезолид обладает достаточно высокой активностью в отношении чувствительных и устойчивых грамположительных бактерий к оксациллину, аминогликозидам, фторхинолонам, макролидам и гликопептидам. Телитромицин ингибирует биосинтез микробного белка у грамположительных бактерий (прежде всего у Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.), проявляет активность в отношении некоторых грамотрицательных бактерий (Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Helicobacter spp.), а также высокоактивен в отношении Chlamydia spp., Mycoplasma spp. Телитромицин (кетолид) сохраняет активность в отношении всех штаммов бактерий, устойчивых к макролидам и линкосамидам. В результате минимальная подавляющая концентрация (МПК) ванкомицина и телитромицина для большинства культур энтеробактерий составляла 0,063 г/дм3, а МПК линезолида была на уровне 0,031 г/дм3. Обильный рост культур энтеробактерий наблюдался при концентрации ванкомицина и телитромицина 0,008 г на дм3 среды, а линезолида в концентрации 0,004 на дм3 среды. В итоге разработанная селективная добавка к питательной среде Drigalski Lactose Agar включает ванкомицин, линезолид и телитромицин (табл. 7). В связи с этим было решено присвоить данной добавке следующее наименование «Селективная добавка ВЛТ». Таблица 7 Состав селективной добавки ВЛТ Препараты антибактериальные Концентрация, г/дм3 Ванкомицин 0,008 Линезолид 0,004 Телитромицин 0,008 Заключение. Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин 30±2,3 из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин 37±2,5 из группы уреидопенициллинов, канамицин 24±1,5, амикацин 26±1,7 и гентамицин 25±0,8, цефепим 38±3,2 из группы цефалоспоринов IV поколения, тетрациклин 28±1,6, доксициклин 34±2,3 и хлорамфеникол 31±2,5, налидиксовая кислота 37±2,8, триметоприм 35±3,4. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов, к стрептомицину, цефалотину из группы цефалоспоринов I поколения, к полимиксину В, к офлоксацину (таривид) и метронидазолу. В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Были выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид, из группы кетолидов телитромицин. В состав разработанной селективной добавки к среде Drigalski Lactose Agar введены антибиотики ванкомицин и телитромицин в дозе 0,008 г/дм3, линезолид в дозе 0,004 г/дм3 среды.

About the authors

Vladimir Viktorovich Ermakov

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

Oksana Olegovna Datchenko

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

Yuliya Aleksandrovna Kurlykova

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

References

  1. Ермаков, В. В. Модификация дифференциально-диагностической среды для выявления и дифференциации энтеробактерий / В. В. Ермаков, О. О. Датченко // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра зоотехнии и ветеринарии. - 2018. - Т. 7, № 1. - С. 174-179.
  2. Поздеев, О. К. Детекция бета-лактамаз амрсуклинических изолятов энтеробактерий / О. К. Поздеев, Н. Ю. Куряева, А. З. Валиуллина [и др.] // Практическая медицина. - 2018. - № 1 (112).- С. 148-152.
  3. Парамонова, Н. Ю. Мониторинг распространения антимикробной резистентности в Костромской области / Н. Ю. Парамонова, В. В. Кузьмичёв, М. Ю. Якубовская // Инновации в АПК: проблемы и перспективы. - 2017. - № 4 (16).- С. 160-163.
  4. Стребкова, В. В. Динамика распространения карбапенемаз грамотрицательных бактерий в отделениях Воронежской городской клинической больницы скорой медицинской помощи № 10 / В. В. Стребкова, О.Н. Затолокина, М.С. Старкова, М.И. Калинина // Многопрофильный стационар. - 2017. - Т.4, №1. - С. 19-21.
  5. Тапальский, Д. В. Металло-бета-лактамазы и карбапенемазы экстремально-антибиотикорезистентных энтеробактерий: распространение в Беларуси / Д. В. Тапальский, В. А. Осипова, Е. О. Евсеенко // Здравоохранение (Минск). - 2017. - № 3. - С. 40-47.
  6. Шепелин, А. П. Современное состояние и тенденции в разработке, производстве и применении питательных сред // Бактериология. - 2016. - Т. 1, № 1. - С. 42-47.
  7. Шелепин, А. П. Современное состояние и направления развития производства питательных сред в России // Современная лабораторная диагностика. - 2015. - № 2 (16). - С. 18-20.
  8. Шилова, А. Н. Характеристика энтеробактерий с множественной резистентностью, колонизирующих кишечный тракт у детей раннего возраста с врождёнными пороками сердца при поступлении в кардиохирургический стационар / А. Н. Шилова, В. Н. Ильина, А. И. Субботовская // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2016. - Т. 18, № 1. - С. 68-74.
  9. Эленшлегер, А. А. Влияние препарата «Ветом 2» на микробный пейзаж кишечника у телят после антибиотикотерапии / А. А. Эленшлегер, В. А. Афанасьеф // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2017. - № 2 (148). - С. 126-132.
  10. Пат. 163081 Российская Федерация, МПК С12М 1/14, А61В 10/02. Одноразовый стерильный микробиологиче-ский г-образный шпатель / Ермаков В. В. - №2016100537/14 ; заявл.11.01.2016 ; опубл. 10.07.2016 ; Бюл. № 19.

Statistics

Views

Abstract - 38

PDF (Russian) - 4

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2019 Ermakov V.V., Datchenko O.O., Kurlykova Y.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies