SOVERShENSTVOVANIE RETsEPTURY PITATATEL'NOY SREDY DRIGALSKI LACTOSE AGAR

Full Text

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в плане диагностики, но и в определении конечного исхода заболевания. Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов. При этом бактериологическая группа методов является одной из трёх ведущих в диагностике инфекционных заболеваний [1, 2, 3, 4]. Одним из важных элементов в лабораторной диагностике острых кишечных инфекций (ОКИ) и оппортунистических инфекций, вызванных энтеробактериями, является выделение возбудителя в чистой культуре на питательных средах [5, 6, 7]. В связи с этим совершенствование рецептуры питательных сред, предназначенных для выделения и дифференциации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, является актуальным и практически значимым. Цель исследований - cовершенствование рецептуры питательной среды Drigalski Lactose Agar производства компании AppliChem, предназначенной для выделения и дифференциации энтеробактерий. Задачи исследований - разработать новую рецептуру питательной среды Drigalski Lactose Agar; определить эффективность культивирования энтеробактерий на применяемых в лабораторной практике питательных средах и на усовершенствованной авторами среде Drigalski Lactose Agar. Материал и методы исследований. Объект исследований - модифицированная авторами дифференциально-диагностическая коммерческая питательная среда, предназначенная для выделения и дифференциации патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, а также для проведения санитарно-бактериологического исследования. Материал для исследований - 253 изолятов бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Сельскохозяйственные животные: коровы, овцы, козы, свиньи, лошади, птица (куры и гуси). Дикие животные: кабаны, лоси, лисы. Зоопарковые животные: пони, верблюд. Домашние животные: кошки и коты, собаки, хорьки, шиншиллы. Исследование проводили в период с 2010 по 2017 гг. Суспензию биоматериала для получения роста культур бактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию биоматериала высевали на питательный агар с эозинметиленовым синим Левина, на среду Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem, на новую среду, приготовленную по разработанной авторами рецептуре. Наряду с перечисленными средами, эшерихии выделяли на средах Эндо и кровяном агаре. Протеи выделяли на агаре П-1 с полимиксином и солями желчных кислот, на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) и кровяном МПА, клебсиеллы выделяли на агаре Плоскирёва и кровяном МПА. Сальмонеллы выделяли на висмут-сульфитном агаре и железо-сульфитном агаре, в селенитовой среде Leifson (коммерческой и модифицированной), а также в магниевой среде, тетротионатовой среде Мюллера и среде Мюллера-Кауфмана, на сальмонелла-шигелла агаре. Иерсинии выделяли на дифференциально-диагностическом СБТС-агаре и селективном CIN-агаре, на глюкозо-кровяном агаре, морганеллы - на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, гафнии - на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, эрвинии - на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, энтеробактеры - на эозинметиленовом агаре, серрации - на пептон-глицериновом агаре, клюйверы - на глюкозо-кровяном агаре, цитробактеры - на висмут-сульфитном агаре и агаре Плоскирева, провиденции - на глюкозо-кровяном агаре, шигеллы выделяли на сальмонелла-шигелла агаре. Суспензию материала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С, 370С 48-72 ч [8]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Подсчёт количества выросших колоний микроорганизмов (КОЕ - колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий). Эффективность культивирования энтеробактерий на применяемых в лабораторной практике питательных средах и на усовершенствованной среде Drigalski Lactose Agar, приготовленной по новой рецептуре определяли по времени появления колоний микроорганизмов и накопления, достаточного для идентификации биоматериала. Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием компьютерной программе Microsoft Excel. Результаты исследований. Работа выполнена на базе кафедры «Эпизоотология, патология и фармакология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Самарская государственная сельскохозяйственная академия» за период с 2010 по 2017 гг. В течение первого этапа исследований проводили выделение, культивирование и идентификацию культур энтеробактерий, полученных от различных видов животных. В ходе второго этапа проводили анализ рецептур питательных микробиологических сред для энтеробактерий, сред обогащения и дифференциально-диагностических сред. Осуществляли подбор питательной основы и формообразователя, стимуляторов роста, углеводов, индикатора, селективных компонентов и ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры для модификации агара Дригальского с лактозой (Drigalski Lactose Agar, AppliChem A5731,0500). Материал исследований - 253 изолята энтеробактерий, выделенные из кишечного микробиотопа различных видов животных. Объект исследований - разработанная новая рецептура дифференциально-диагностической питательной среды Drigalski Lactose Agar с селективной добавкой. Рецептура среды Drigalski Lactose Agar производства компании AppliChem имеет следующий состав (г/л): пептон 15,0 г, мясной экстракт 3,0 г, дрожжевой экстракт 3,0 г, дезоксихолат натрия 1,0 г, натрия тиосульфат 1,0 г, лактоза 15,0 г, кристаллический фиолетовый 0,005 г, бромтимоловый синий 0,08 г, агар 11,0 г. Среда имеет pH 7,3±0,2. Выделение, культивирование и идентификация культур энтеробактерий. Суспензию биоматериала (фекалии животных) для получения роста культур энтеробактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию биоматериала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С, 370С 48-72 ч, в зависимости от выделяемой культуры энтеробактерий [8]. Чистые культуры энтеробактерий идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Подсчёт количества выросших колоний микроорганизмов (КОЕ - колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий). Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием PC Pentium с помощью приложения Microsoft Office 2003 Excel-7. Результаты исследований. В ходе создания новой рецептуры Drigalski Lactose Agar проводился подбор питательной основы и формообразователя питательной среды. В качестве агаровой основы для модификации лактозного агара использовали агар бактериологический сухой производства ФБУН ГНЦ МПБ Оболенск (Россия). В ходе выбора питательной основы и стимуляторов роста учитывали полноценность компонентов по набору питательных веществ и их доступность для микроорганизмов. С целью обогащения питательной основы высокомолекулярными пептидами в рецептуру среды ввели пептон ферментативный бактериологический с высоким содержанием триптофана производства HiMedia Laboratories (Индия). Пептон, полученный путём ферментативного гидролиза с использованием пепсина и трипсина, содержит большое количество высокомолекулярных пептидов и аминокислот. В качестве стимуляторов роста энтеробактерий в рецептуру питательной среды решено было ввести аминопептид, экстракт хлебных дрожжей. В ходе выбора минеральных компонентов учитывали потребность в них энтеробактерий, взаимодействие их с другими компонентами среды, предполагаемую диагностическую информативность и ингибирующий эффект на сопутствующую микрофлору. Натрия хлорид необходим для создания изоосмотических условий среды, оптимально подходящих для роста и размножения микроорганизмов. Натрия хлорид ингибирует рост сопутствующих грамположительных стрептококков. Углеводы ввели в рецептуру среды для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и маннита. Углеводы лактоза и маннит входят в пропись А среды, а глюкоза и сахароза включены в пропись Б среды. Углеводы служат наилучшим источником углерода для большого спектра микроорганизмов. Желатин решено ввести в рецептуру среды с целью выявления протеолитической активности у энтеробактерий, в частности у представителей рода Proteus. Краситель фуксин основной необходим для дифференциации энтеробактерий, ферментирующих главным образом лактозу. В качестве индикатора были выбраны доступные и наиболее часто используемые в рецептурах дифференциально-диагностических питательных сред индикатор Андреде с индикатором ВР. В состав индикатора Андреде входит фуксин кислый, гидроксид натрия 1N и дистиллированная вода. Комбинированный индикатор ВР состоит из водного голубого и розоловой кислоты (аурин, пэонин или красный кораллин). В качестве селективных ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры решено использовать антибиотики, находящиеся в селективной добавке к среде. Таким образом, рецептура модифицированного лактозного агара имеет состав, состоящий из двух прописей А и Б (табл. 1). Работа с модифицированной питательной средой предусматривает использование двухсекционных одноразовых чашек Петри. При этом можно использовать также многоразовые стеклянные чашки Петри с перегородкой, делящей чашку на две равные секции. В одну секцию наливают компонент А модифицированного лактозного агара, в другую секцию разливают компонент Б. Таблица 1 Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose Agar Компоненты среды Пропись А (г/дм3) Пропись Б (г/дм3) Агар бактериологический 12,0 12,0 Панкреатический гидролизат рыбной муки 5,0 5,0 Панкреатический гидролизат казеина 5,0 5,0 Пептон ферментативный бактериологический с высоким содержанием триптофана 5,0 5,0 Аминопептид 2,0 2,0 Экстракт хлебных дрожжей 2,0 2,0 Желатин 0,5 0,5 Натрия хлорид 5,0 5,0 Натрия карбонат 0,5 0,5 Натрия сульфит 0,5 0,5 Натрия тиосульфат 0,3 0,3 Железо (II) сульфат 1,0 1,0 Углевод Лактоза 10,0 Глюкоза 10,0 Углевод Маннит 7,0 Сахароза 7,0 Фуксин основной 1,0 1,0 Индикатор Андреде с индикатором ВР 0,2 0,2 Выявление эффективности питательных дифференциально-диагностических сред с селективным эффектом проводилось согласно времени, необходимом для образования на средах колоний энтеробактерий семейства Enterobacteriaceae 1-3 мм в диаметре. Время культивирования энтеробактерий, выделенных от сельскохозяйственных животных, составило от 18,28±1,56 до 33,28±3,58 ч (табл. 2), а от диких животных - от 16,28±1,44 до 33,74±4,14 ч (табл. 3). Таблица 2 Время культивирования энтеробактерий, выделенных от сельскохозяйственных животных Культуры энтеробактерий Время культивирования, ч Эндо агар Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem Новая рецептура Drigalski Lactose Agar Escherichia coli 22,82±1,12 22,56±0,74 20,34±0,85 Salmonella Enteritidis 28,34±3,26 26,14±1,84 20,76±1,12 Klebsiella oxytoca 26,54±2,32 27,44±1,82 22,28±0,94 Proteus vulgaris 30,48±2,64 28,16±2,32 23,14±1,22 Providencia alcalifaciens 33,28±3,58 29,18±2,66 21,52±1,35 Hafnia alvei 28,56±2,74 27,36±2,52 22,54±1,26 Morganella morganii 28,66±2,52 26,18±2,36 20,58±1,64 Enterobacter cloacae 27,58±2,44 26,64±1,88 18,66±0,78 Citrobacter freundii 28,26±2,66 27,12±2,52 23,75±1,88 Serratia marcescens 25,74±2,78 27,48±2,38 22,68±1,32 Erwinia amylovora 32,58±3,42 30,22±2,14 25,72±1,34 Kluyvera cryocrescens 26,38±2,88 24,58±2,22 21,25±1,36 Yersinia enterocolitica 23,76±1,34 20,36±1,78 18,28±1,56 Таблица 3 Время культивирования энтеробактерий, выделенных от диких животных Культуры энтеробактерий Время культивирования, ч Эндо агар Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem Новая рецептура Drigalski Lactose Agar 1 2 3 4 Escherichia coli 21,32±0,75 20,14±1,12 16,28±1,44 Shigella dysenteriae 28,56±2,16 25,32±1,74 23,38±1,52 Shigella flexneri 33,42±1,72 28,33±2,08 26,76±1,88 Salmonella Enteritidis 25,56±1,18 23,88±1,36 20,44±1,06 Klebsiella oxytoca 27,38±1,84 27,17±2,08 23,14±1,76 Proteus vulgaris 28,44±1,57 26,12±1,88 22,86±1,12 Providencia alcalifaciens 28,87±2,18 27,30±1,94 18,59±2,04 Hafnia alvei 27,30±1,68 25,22±1,60 20,34±0,94 Окончание табл. 3 1 2 3 4 Morganella morganii 26,88±1,78 24,56±1,80 22,33±1,26 Enterobacter cloacae 29,18±1,33 24,28±1,66 19,52±1,34 Citrobacter freundii 26,08±1,82 25,88±1,06 20,55±1,38 Serratia marcescens 27,34±1,66 25,29±1,43 20,83±1,90 Erwinia amylovora 30,73±2,06 27,12±1,83 24,68±1,78 Kluyvera cryocrescens 28,77±4,67 27,89±3,88 25,08±2,13 Yersinia enterocolitica 22,74±0,95 19,64±1,13 16,56±0,82 Время культивирования энтеробактерий, выделенных от зоопарковых животных, составило от 17,06±3,78 до 36,52±2,08 ч (табл. 4), а от домашних животных составило от 18,72±2,32 до 42,18±4,12 ч (табл. 5). Таблица 4 Культивирование энтеробактерий, выделенных от зоопарковых животных Культуры энтеробактерий Время культивирования, ч Эндо агар Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem Новая рецептура Drigalski Lactose Agar Escherichia coli 19,04±1,14 20,32±1,22 21,86±1,52 Shigella dysenteriae 30,24±1,62 27,52±1,38 25,08±1,08 Shigella flexneri 28,15±2,32 28,08±2,16 26,43±2,76 Salmonella Enteritidis 25,24±1,86 22,44±2,34 25,42±2,89 Klebsiella oxytoca 25,44±2,65 28,06±2,55 26,22±1,94 Proteus vulgaris 30,28±3,65 28,18±2,38 30,66±1,24 Providencia alcalifaciens 29,76±1,34 36,52±2,08 31,76±2,87 Hafnia alvei 26,78±1,08 30,54±2,12 27,88±2,56 Morganella morganii 28,55±2,76 27,16±3,88 30,56±2,98 Enterobacter cloacae 20,86±3,12 25,65±2,78 26,45±3,08 Citrobacter freundii 26,89±2,67 25,98±3,18 27,12±3,56 Serratia marcescens 26,39±3,22 28,87±2,90 25,76±2,89 Erwinia amylovora 23,34±1,72 26,30±2,15 27,88±5,32 Kluyvera cryocrescens 27,44±2,54 24,12±1,62 28,78±3,76 Yersinia enterocolitica 25,88±3,65 17,06±3,78 21,83±1,66 Таблица 5 Культивирование энтеробактерий, выделенных от домашних животных Культуры энтеробактерий Время культивирования, ч Эндо агар Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem Новая рецептура Drigalski Lactose Agar Escherichia coli 22,32±2,08 26,46±2,58 18,72±2,32 Shigella dysenteriae 38,66±2,74 39,56±2,64 33,45±2,45 Shigella flexneri 32,78±1,86 36,44±2,82 26,08±1,62 Salmonella Enteritidis 30,44±2,70 26,86±1,52 20,34±1,08 Klebsiella oxytoca 36,68±1,32 30,18±1,14 22,74±2,94 Proteus vulgaris 38,62±2,40 26,14±2,56 22,18±1,06 Providencia alcalifaciens 38,08±3,44 35,74±3,84 26,74±1,10 Hafnia alvei 30,04±2,64 27,44±3,88 24,16±1,22 Morganella morganii 29,89±3,18 25,88±4,68 25,90±3,70 Enterobacter cloacae 26,12±2,78 28,70±1,44 23,80±1,68 Citrobacter freundii 30,96±3,74 28,52±3,56 25,08±1,73 Serratia marcescens 33,94±2,18 30,18±3,34 20,56±1,96 Erwinia amylovora 38,08±3,64 37,12±3,48 24,62±2,06 Kluyvera cryocrescens 42,18±4,12 38,68±3,08 26,50±2,46 Yersinia enterocolitica 36,26±2,18 30,48±2,82 21,80±1,42 Видовой состав энтеробактерий, выделенных от различных видов животных, состоял из представителей семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Providencia, Hafnia, Morganella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Kluyvera, Yersinia. Доля патогенных энтеробактерий у животных была не значительной: Salmonella Enteritidis (0,012-0,24%), Shigella dysenteriae и Shigella flexneri (0,003-0,01%), Klebsiella oxytoca (2,44-3,12%), Yersinia enterocolitica (0,04-0,12%). При этом шигеллы не были выделены у сельскохозяйственных животных. Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose Agar имеет следующий состав (г/дм3): агар бактериологический - 12,0, панкреатический гидролизат рыбной муки - 5,0, панкреатический гидролизат казеина - 5,0, пептон ферментативный бактериологический с высоким содержанием триптофана - 5,0, аминопептид - 2,0, экстракт хлебных дрожжей - 2,0, желатин - 0,5, натрия хлорид - 5,0, натрия карбонат - 0,5, натрия сульфит - 0,5, натрия тиосульфат - 0,3, железо (II) сульфат - 1,0, фуксин основной - 1,0, индикатор Андреде с индикатором ВР - 0,2. Среда готовится по прописи А и Б. В прописи А содержится лактоза - 10,0 и маннит - 7,0 (г/дм3), а в прописи Б содержится глюкоза - 10,0 и сахароза - 7,0 (г/дм3). Дифференциация энтеробактерий, культивируемых на среде, изготовленной по данной рецептуре, проводится по их способности ферментировать лактозу, маннит, глюкозу, сахарозу, желатин и образовывать сероводород. Среда может также использоваться для проведения санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста. Эффективность культивирования энтеробактерий, выделенных от различных видов животных, на наиболее часто применяемых дифференциально-диагностических средах, в том числе с использованием новой рецептуры среды Drigalski Lactose Agar, составляла от 16,28±1,44 до 42,18±4,12 ч. Энтеробактерии, выделенные от сельскохозяйственных и диких животных, образовывали колонии на модифицированном агаре Дригальского с лактозой в течение 24 ч, а энтеробактерии, выделенные от зоопарковых животных, в течение 25-31 ч. Энтеробактерии, выделенные от домашних животных, образовывали колонии на модифицированном агаре в течение 18-27 ч. В результате культивирование с применением новой рецептуры среды Drigalski Lactose Agar с селективной добавкой позволяет сократить время культивирования энтеробактерий, выделенных от различных видов животных. Заключение. Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose Agar содержит оптимальный набор веществ, удовлетворяющий ростовые потребности энтеробактерий, и позволяет сократить время на выделение и дифференциацию условно-патогенных и патогенных энтеробактерий.

About the authors

Vladimir Viktorovich Ermakov

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

Oksana Olegovna Datchenko

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

Yuliya Aleksandrovna Kurlykova

Email: Vladimir_21_2010@mail.ru

References

Supplementary files