FEATURES OF REPARATIVE REGENERATION OF ACHILLES TENDON IN THE CONDITIONS OF AUTOLOGOUS TRANSPLANTATION OF CELL POOL

Full Text

Изучение восстановительных потенций тканей опорно-двигательного аппарата и путей направленного воздействия на ускорение репаративных процессов - одна из фундаментальных проблем ветеринарной травматологии и ортопедии [6, 7]. Стремительное развитие науки в области регенеративной медицины и клеточной биологии, фундаментальные исследования и поиск перспективных терапевтических подходов в данном направлении обещают в ближайшем будущем новые открытия. Высокий интерес к технологиям применения различных стволовых клеток во многом определен их потенциалом в восстановлении поврежденных тканей и органов [1, 3]. Суть применения таких технологий заключается в стимуляции восстановления поврежденных сухожилий с помощью клеток, взятых из организма самого объекта. Аутологичные клетки не отторгаются организмом животного после введения, поскольку распознаются его защитными системами как собственные [2, 3]. Современные регенеративные методы лечения животных с повреждениями сухожилий предполагают применение стромально-васкулярных клеток жировой ткани. Известно, что они представляют популяцию клеток, обладающих высокой степенью пластичности, пролиферативной активностью и способностью к секреции множества ангиогенных факторов [4, 5, 7]. Вместе с тем, отсутствуют данные о морфологических и морфометрических эквивалентах регенераторного процесса при их применении в условиях повреждения сухожильно-связочного аппарата. Цель исследований - выявить особенности заживления ахиллова сухожилия в условиях аутотрансплантации клеточного продукта, отражающие регенераторную активность стромально-васкулярной фракции. Задачи исследований - установить сравнительные микроморфометрические показатели пучков коллагеновых волокон ткани сухожилия 1 и 2 порядка в области травмы у животных экспериментальных групп (интактная, контрольная и подопытная); представить микроморфометрические показатели фибробластической популяции в сравниваемых группах; охарактеризовать степень васкуляризации ткани регенерата в зоне повреждения. Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры «Анатомия и гистология животных им. профессора А. Ф. Климова» ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К. И. Скрябина на трех группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (интактная, контрольная и подопытная), подобранных по принципу аналогов. Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы. Использовали комплексный методический подход, включающий экспериментальное моделирование с целью получения аутологичного клеточного продукта, анатомическое препарирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия, микроморфологические исследования, микроморфометрию и статистическую обработку данных. В контрольной группе область повреждения заживала самопроизвольно, в подопытной группе - под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Ахиллово сухожилие животных интактной группы использовали для определения нормативных микроморфометрических показателей. Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания их на двухнедельном карантине. Изучение общей микроморфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином по Ван-Гизону по общепринятым методикам. Микроморфометрию осуществляли с помощью программы «ImagScope». Оценку статистической значимости различий исследуемых показателей осуществляли с использованием критерия Стьюдента. Результаты исследований. Как известно, ткань сухожилия относится к группе соединительных тканей, являясь плотной оформленной соединительной тканью. У крыс ее строение подчинено общим закономерностям, которые присущи животным других таксономических групп. Установлено, что функциональной единицей ткани является участок межклеточного вещества с сухожильными клетками, который окружен артериоло-венулярным анастомозом. Каждая функциональная единица характеризуется четкой цито-, фибро- и ангиоархитектоникой. Коллагеновые волокна окружены эндотеноном, вдоль которого располагаются цепочки клеток фибробластической популяции и сосуды капиллярного русла. На основании данных сравнительного микроморфометрического анализа регенерата в исследуемых группах установлено, что на 7 сутки у особей контрольной группы пучки коллагеновых волокон первого порядка тонкие, не имеют строгой ориентационной упорядоченности и четких границ, в отличие от пучков первого порядка у крыс подопытной группы, которые по параметрам толщины коллагеновых конструкций опережали группу контроля. На 14 сутки наблюдений тенденция к увеличению толщины пучков сохранялась с преимуществом у подопытной группы. К 30 суткам эксперимента у крыс подопытной группы толщина пучков первого порядка существенно возрастала по сравнению с предыдущим сроком наблюдений. Следует отметить, что сами волокна приобретают волнистую конфигурацию, свойственную морфологической организации сухожилия в норме. На заключительном сроке эксперимента выявлены достоверные различия в показателях толщины пучков первого порядка у животных сравниваемых групп. Более того, морфометрические показатели сухожильной ткани у животных подопытной группы на 60 сутки практически соответствовали параметрам нормы (параметрам интактной группы) (табл. 1). Таблица 1 Микроморфометрические показатели пучков первого порядка ахиллова сухожилия крыс в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05) Сроки эксперимента Группа животных I группа (контроль) II группа (подопытная) III группа (интактная) 7 сутки 3,34±0,79 3,78±0,92 8,35±1,02 14 сутки 3,55±0,79 4,86±0,45 30 сутки 4,71±0,69 6,14±0,79 60 сутки 4,76±0,50 6,42±0,67 При изучении микроморфометрических показателей на 14 сутки эксперимента было установлено, что на данном сроке регенеративного процесса в ткани сухожилия формируются хорошо различимые пучки второго порядка. Представители подопытной группы достоверно опережают по их толщине своих контрольных аналогов. Этот процесс усиливается к 30 суткам эксперимента. На заключительном сроке эксперимента (60 сутки) показатель толщины волокон в подопытной группе становится равен 40,1±6,8 мкм, что соответствует состоянию сухожильной ткани в норме (показатель толщины составляет 43,0±4,85 мкм) (табл. 2). Таблица 2 Микроморфометрические показатели пучков второго порядка ахиллова сухожилия крыс в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05) Сроки эксперимента Группа животных I группа (контроль) II группа (подопытная III группа (интактная) 14 сутки 17,6±2,37 23,2±3,41 43,0±4,85 30 сутки 25,3±6,94 30,2±3,58 60 сутки 33,4±7,11 40,1±6,8 При сравнительном анализе цитоархитектоники, и прежде всего клеток фибробластической популяции, выявлено, что на ранних сроках регенерации они многочисленны, так как способствуют формированию новой сухожильной ткани в зоне дефекта и тем самым активно задействованы в процессе коллагеногенеза. Вместе с тем, в подопытной группе обнаружено их достоверное, по сравнению с контролем, количественное уменьшение, в связи с приобретением фенотипа фиброцитов, что может отражать стадийность ремоделирования цитоархитектоники, которое начинается со стороны эндотенона (табл. 3). Таблица 3 Количество фибробластов в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс в контрольной, подопытной и интактной группах, шт. Сроки эксперимента Группа животных I группа (контроль) II группа (подопытная) III группа (интактная) 7 сутки 121 102 36 14 сутки 98 77 30 сутки 74 61 60 сутки 59 48 Одним из важных критериев полноценной регенерации сухожильной ткани является степень ее васкуляризации. При микроморфометрических исследованиях кровеносного русла ткани регенерата существенных различий между показателями их количества в сравниваемых группах не обнаружено. Вместе с тем, на 30 сутки наблюдений у животных в подопытной группе насыщенность ткани сухожилия капиллярами превосходит таковую в контроле. Из этого следует, что стромально-васкулярная фракция существенное влияние на развитие капиллярной сети в области дефекта оказывает на 30 сутки эксперимента (табл. 4). Таблица 4 Количество кровеносных капилляров в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс в контрольной, подопытной и интактной группах, шт. Сроки эксперимента Группа животных I группа (контроль) II группа (подопытная) III группа (интактная) 7 сутки 3 5 6 14 сутки 5 6 30 сутки 4 8 60 сутки 4 6 Заключение. Установлены особенности репаративной регенерации при индуцированном повреждении ахиллова сухожилия в условиях трансплантации аутологичного клеточного продукта - стромально-васкулярной фракции, выражающиеся в формировании в области повреждения органоспецифического регенерата и сокращений общих сроков заживления. Механизм ускоренной, в сравнении с контролем, регенерации травмированного сухожилия при аутотрансплантации тестируемого клеточного продукта связан со стимуляцией в области регенерата коллагено- и ангиогенеза, что коррелирует с установленными микроморфометрическими показателями. Установленные микроморфометрические показатели регенерата в области индуцированной травмы ахиллова сухожилия, направленные на стимуляцию и трофическое обеспечение регенераторного процесса, свидетельствуют о перспективности применения аутологичной стромально-васкулярной фракции в клинической практике при заживлении травм сухожилий у животных.

About the authors

N. A Slesarenko

FSBEI HE Moscow State Academy of Veterinary Medicine characteristics and Biotechnology K. I. Scryabin

Email: slesarenko2009@yandex.ru
Doctor ontogenesis of Biological academy Sciences,Professor,Head functional of the Department «Animal Anatomy and Histology named after Professor A. F. Klimov» Moscow

A. M. Zharikov

FSBEI HE Moscow State Academy вof Veterinary Medicine characteristics and Biotechnology K. I.Scryabin

Email: am.zharikov@gmail.com
Graduate Student of the Department «Animal Anatomy and Histology named after Professor A. F.Klimov»

References

Supplementary files