ВЛИЯНИЕ КЛЕТОК СТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ НА РЕПАРАТИВНУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ ИНДУЦИРОВАННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ АХИЛЛОВА СУХОЖИЛИЯ

Полный текст

Одним из направлений в регенеративной медицине является использование аутологичных клеточных продуктов, действие которых направлено на оптимизацию регенераторного процесса в зоне повреждения [1, 5, 7]. Среди клеточных препаратов наибольшей биологической безопасностью отличаются аутологичные. Из них в клинической практике положительно зарекомендовали себя клетки стромально-васкулярной фракции (СВФ) и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), обладающие способностью к самоподдержанию, дифференцировке в различные клеточные типы и мобилизующие в тканях репаративный процесс. Однако для внедрения клеточной терапии в ветеринарную практику требуется научное обоснование, основанное на комплексных экспериментальных исследованиях, являющихся базовыми для оценки возможностей применения аутологичных клеточных продуктов для восстановления анатомической целостности органов, поддержания структурного гомеостаза, профилактики рубцовых изменений в травмированной зоне, а также конкретизации показаний к применению и разработки схем лечения [3, 5, 6, 7]. Вместе с тем, практически отсутствуют сведения о динамическом морфологическом контроле процесса репарации при их применении [2, 4]. Цель исследований - морфологическое обоснование эффективности применения клеточных продуктов при разрыве ахиллова сухожилия. Задачи исследований: 1) установить особенности анатомической организации ахиллова сухожилия у крыс; 2) представить морфологическую характеристику спонтанного заживления индуцированного повреждения сухожильной ткани; 3) охарактеризовать микроморфологическое состояние регенерата ахиллова сухожилия подопытной группы в динамике восстановительного процесса (на 7, 14, 30 и 60 сутки) под влиянием СВФ. Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры анатомии и гистологии животных имени профессора А. Ф. Климова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К. И. Скрябина и ООО «Центр ветеринарной клеточной медицины» на двух группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (контрольной и подопытной), подобранных по принципу аналогов. Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы. Животных карантинировали в течение 14 суток, проводили общеклиническое исследование. Использовали комплекс методов, включающих анатомическое препарирование, экспериментальное моделирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия. В контрольной группе область повреждения заживала естественным путем, а в подопытной группе - под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Травму моделировали посредством поперечного разреза дистальной трети ахиллова сухожилия, ближе к месту прикрепления к пяточной кости заплюсны. В условиях полного расслабления мышц область повреждения сухожилия сшивали специальным швом. Животным подопытной группы стромально-васкулярную фракцию вводили однократно в объеме 1 мл подкожно в область дефекта на расстоянии 5 мм от области травмы с двух сторон. У крыс контрольной группы область повреждения регенерировала самопроизвольно. Проводили динамическое наблюдение за животными до момента выведения из эксперимента, которое осуществляли на 7, 14, 30 и 60 сутки путем эвтаназии в соответствии с требованиями этического комитета. Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных научных целей» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания двухнедельного карантина. Для гистологических исследований образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации образцы промывали водопроводной водой (24 часа), обезвоживали в спиртах возрастающей крепости (от 50% до 100%) и заливали в парафин-воск. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм изготавливали на универсальном автоматизированном микротоме «HM-360» (Mikron, Германия). Изучение общей морфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону по общепринятым методикам. Результаты исследований. На основании данных анатомического препарирования установлено, что в формировании ахиллова сухожилия у крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев (рис. 1-4). Рис. 1. Макроморфология пяточных ветвей двуглавой мышцы, участвующих в формировании ахиллова сухожилия Рис. 2. Макроморфология пяточных ветвей полусухожильной мышцы, участвующей в формировании ахиллова сухожилия Рис. 3. Макроморфология латеральной и медиальной икроножных мышц, участвующих в формировании ахиллова сухожилия Рис. 4. Макроморфология поверхностного сгибателя пальцев, участвующего в формировании ахиллова сухожилия На основании результатов микроморфологического исследования регенерата ахиллова сухожилия животных установлено, что у животных подопытной группы на 7 сутки пучки коллагеновых волокон в зоне дефекта характеризуются упорядоченной ориентацией, в то время как у животных в группе контроля они разнонаправлены. Это может свидетельствовать о стимуляции регенеративных процессов в области индуцированного повреждения при введении стромально-васкулярной фракции (рис. 5). а б Рис. 5. Микроморфологическая картина регенерата сухожилия на 7 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна При сравнительном анализе регенерата сухожилия на 14 сутки было установлено, что у животных подопытной группы, которым вводили аутологичный клеточный продукт, четко выражено взаимно параллельное расположение коллагеновых волокон с видимыми границами дифференциации на пучки первого и второго порядков. Более того, волокна приобретают волнистый ход, что может свидетельствовать о наличии у них резерва длины при натяжении. У крыс в контрольной группе на 14 сутки наблюдений пучки волокон сохраняют разнонаправленную организацию, что может свидетельствовать о риске возможных рецидивов. Кроме того, микроморфологическая картина сухожилия в подопытной группе характеризуется увеличением, по сравнению с контролем, клеток соединительной ткани, а также толщины пучков коллагеновых волокон. Все это отражает стимулирующее влияние аутологичной суспензии клеток СВФ на репарацию ткани сухожилия (рис. 6). а б Рис. 6. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 14 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний На 30 сутки регенеративные процессы в зоне дефекта были направлены на улучшение васкуляризации клеточных структур регенерата и увеличение количества фибробластов в подопытной группе по сравнению с группой контроля, в которой только происходит формирование пучков волокон. Под действием стромально-васкулярной фракции активнее протекает формирование и созревание грануляционной ткани. Фиброзная ткань замещает область дефекта вследствие действия суспензии (рис. 7). а б Рис. 7. Микроморфологическая характеристика. Структурная организация регенерата сухожилия на 30 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний; 4 - перитеноний Представленные данные свидетельствуют, что на финальном этапе эксперимента (60 сутки) в подопытной группе, в сравнении с контрольной группой, произошло полное заживление дефекта сухожилия. Важнейшим критерием, отражающим полное восстановление травмированного сухожилия, является упорядоченность фиброархитектоники, взаимно параллельное расположение волокон и утолщение их пучков. Кроме того, подопытным образцам присуща большая, по сравнению с регенератом, образующемся при самопроизвольном заживлении, степень их васкуляризаци. В контрольной группе, даже на 60 сутки наблюдения, вновь образованная соединительная ткань не имеет четкого структурного оформления, что может являться фактором риска возникновения рецидивов повреждения (микронадрывов ткани) (рис. 8). а б Рис. 8. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 60 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний; 4 - перитеноний Заключение. На основании проведенных исследований установлено: 1) в структурном оформлении ахиллова сухожилия крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев; 2) у подопытных животных обнаружены микроморфологические преобразования соединительной ткани, направленные на упорядоченность фиброархитектоники и утолщение пучков коллагеновых волокон, в то время как у животных контрольной группы - нарушения упорядоченности волокон, что способствует возникновению рецидивов; 3) микроморфологические показатели свидетельствуют о положительном результате экспериментальной апробации применения аутологичной суспензии клеток СВФ при лечении животных с разрывом сухожилий.

Об авторах

Наталья Анатольевна Слесаренко

ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина»

Email: slesarenko2009@yandex.ru
д-р биол. наук, профессор, зав. кафедрой «Анатомия и гистология животных им. профессора А. Ф. Климова» г. Москва

Алексей Михайлович Жариков

ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»

Email: am.zharikov@gmail.com
аспирант кафедры «Анатомия и гистология животных им. профессора А. Ф. Климова» г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы