Analiz kompleksnogo vozdeystviya ul'trazvukovoy kavitatsii i tsitokinoterapii na faktory antimikrobnoy rezistentnosti pri kandidozno-mikoplazmennoy infektsii genital'nogo trakta

Full Text

Введение Повышение эффективности терапии воспалительных заболеваний органов малого таза является весьма актуальной задачей в связи с наблюдаемым в последнее десятилетие стабильно-устойчивым ростом инфекций, передаваемых половым путем, характеризующихся торпидным течением, частыми рецидивами и значительным количеством осложнений [1, 2]. Наиболее часто среди заболеваний нижнего отдела репродуктивного тракта регистрируется микст-инфекция(C.albicans+U.urealyticum+M. hominis), где главной составляющей в процентном отношении являются грибы C.albicans [3, 4]. Особенности существования и взаимоотношений грибов рода кандида и микоплазм с другими патогенными и условно-патогенными микроорганизмами отражаются на специфичности клинической картины, влияют на стадийность и длительность заболевания. Снижение факторов местной противоинфекционной защиты, изменение реактивности организма, регистрируемое при заболеваниях, передающихся половым путём, ведет к длительной персистенции инфекционного агента, хронизации и рецидивированию воспалительного процесса [5, 6, 7]. Поэтому течение и исход заболеваний урогенитального тракта, вызванных микоплазмами, как и любого инфекционного процесса, определяется состоянием факторов местной противоинфекционной защиты репродуктивного тракта [8, 9]. Исследования клеточных и гуморальных факторов местного иммунитета в секретах репродуктивного тракта женщин свидетельствуют о выраженных нарушениях антимикробной защиты слизистых оболочек при микоплазменной инфекции [6]. Недостаточная эффективность антибактериальной терапии, длительные и неоднократные курсы лечения приводят к ещё большему угнетению факторов местного иммунитета [1, 9]. Вышеперечисленные обстоятельства требуют поиска новых методов, нормализующих локальный иммунный статус. Клинические и экспериментальные исследования, проведённые в последнее десятилетие, свидетельствуют о возможности модуляции иммунных реакций организма при воздействии на него физиотерапевтических агентов и иммуномодулирующих препаратов [3, 4, 5]. В стратегическом плане заслуживает внимание изучение ультразвуковых кавитационных воздействий для оценки его влияния на факторы врожденного иммунитета репродуктивного тракта и возможности повышения эффективности терапевтических мероприятий при лечении урогенитальных микст-инфекций [3, 4]. Ультразвуковые кавитационные воздействия низкой частоты, с успехом применяемые на протяжении многих лет для лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта, могут выступить в роли средства положительно влияющего на нормализацию локальных иммунных факторов поскольку, установлено, что данный тип воздействий влияет практически на все составляющие патологического процесса: клеточный, гуморальный, тканевой и органный, оказывая местное неспецифическое воздействие на факторы колонизационной резистентности репродуктивного тракта [3, 4, 5]. Под воздействием низкочастотного ультразвука создаётся переменное звуковое давление, акустические течения, приводящие к макроочистка слизистых оболочек, микромассажное воздействие и кавитация озвучиваемой среды, происходит повышение проницаемости клеточных мембран, улучшение микроциркуляции тканей и снижение активности воспалительного процесса. Кроме того, воздействие ультразвука сопровождается образованием перекисей, действующих бактерицидно. Вышеперечисленные обстоятельства делают возможным его применение в комплексной терапии урогенитальных инфекций [3, 4]. Это подтверждается и рядом публикаций, о включении комплекса физиотерапевтических мероприятий в лечебный процесс, совместно с традиционными (базисными) методами [1, 2, 3, 5, 6, 8]. Немаловажным является и тот факт, что воздействие ультразвуком низкой частоты в комплексе с иммуномодулирующей терапией позволяет, на сегодняшний день, провести направленную коррекцию не только локомоторных нарушений нейтрофилов- доминирующих клеток секретов репродуктивного тракта, и индикаторов локального воспалительного процесса, но и их секреторных возможностей. В связи с вышеизложенными обстоятельствами и с учетом наработок коллектива НИИ Иммунологии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития под руководством член. -корреспондента РАМН И.И. Долгушина разработка и изучение комплексных неинвазивных методов (ультразвуковая кавитация и локальная цитокинотерапия), устраняющих дисфункции локальных факторов антимикробной защиты представляется авторам актуальной и своевременной темой исследования [1, 2]. Кроме того, местное лечение с применением ультразвуковой кавитации и цитокинотерапии позволяет добиться клинической и этиологической излеченности даже в тех случаях, когда предшествующая терапия антибиотиками не была успешной. Доказанная активность рекомбинантного IL-2 в отношении вирусов герпеса, хламидий и микоплазм с учётом спектра его биологической активности делает возможным его применение в комплексе терапевтических мероприятий при лечении воспалительных заболеваний нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванных уреамикоплазмами тем более, что ранее проведёнными исследованиями доказано, что рекомбинантный IL-2, восстанавливая синтез эндогенного( собственного) IL-2 активированными СD4+ и СD8+ клетками, приводит к регуляции иммунных механизмов, стимулирует реализацию иммунного ответа, включает синтез IFN, исключая передозировку, не обладая при этом антигенностью. Эффекты комплексного воздействия ультразвуковой кавитации и локальной цитокинотерапии обусловлены тем, что струйное орошение ультраозвученным раствором рекомбинантного IL-2 позволяет сочетать мелкодисперсное распыление раствора лекарственного вещества с одновременным низкочастотным ультразвуковым воздействием, которое уже само по себе оказывает антисептический (бактерицидный или бактериостатический эффект). Вполне возможно, что ультразвуковая кавитация модифицируя конформацию белковых молекул мембран нейтрофилов клеток-эффекторов воспалительной реакции организма человека клетками [8], играющих важнейшую роль в поддержании иммунного гомеостаза, наиболее активно воспринимающими данный вид воздействий, приводит к изменению метаболических процессов и, как следствие, функциональной активности нейтрофила, а иммуномодулирующий препарат Ронколейкин закрепляет это воздействие. Вышеперечисленные обстоятельства делают проводимое исследование актуальным и своевременным, что и определило следующую цель- изучить влияние локальной ультразвуковой кавитационной и цитокинотерапии раствором рекомбинантного IL-2 на состояние антимикробной защиты цервикального канала у женщин с сочетанной кандидозно-микоплазменной инфекцией. Материалы и методы исследования Для достижения поставленной цели было проведено краткосрочное, проспективное, простое, рандомизированное исследование комплексного влияния ультразвуковой кавитационной терапии и локальной иммуномодулирующей терапии рекомбинантным IL-2 на состояние антимикробной защиты цервикального канала у женщин с сочетанной кандидозно-микоплазменной инфекцией у 120 пациенток в возрасте от 19 до 39 лет, у которых, выявлена методом ПЦР с использованием тест-систем «АмплиСенс» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (Москва) микоплазменная инфекция, (U.urealyticum+M.hominis в титре ≥КОЕ 104), а наличие грибов рода Candida подтверждено культуральным методом с посевом на среду Сабуро. Диагностика урогенитальных микоплазм проводилась согласно медицинской технологии ФС № 2010/007 «Показания и тактика терапии пациентов с урогенитальной микоплазменной инфекцией в зависимости от генетической вариабельности генитальных микоплазм», рекомендованной ФГУ «УрНИИДВиИ» г. Екатеринбург. Пациентки, участвовавшие в исследовании, дали письменное добровольное информированное согласие в соответствии с требованиями Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации от 1964 года, дополненной в 1975 г., 1983 г., 1989 г., 2000 г., 2002г.; основами законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан, правил проведения клинической практики в РФ», (приказ МЗ РФ № 266 от 19.07.03; приказ Росздравнадзора № 2325-Пр/06 от 17.10.06). Материалом для исследования служил секрет цервикального канала, который забирали с помощью стерильной градуированной пипетки. В цервикальной слизи был исследован качественный и количественный состав лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных клеток. При оценке функциональной активности нейтрофилов слизи, изучали их фагоцитарную и лизосомальную активность по методу И.С.Фрейдлин, кислородзависимый метаболизм и функциональный резерв в НСТ-тесте был исследован по методикам, разработанным А.Н Маянским в модификации проф. И.И.Долгушина. Определение содержания цитокинов (IL-1α, IL-1β, IL-8, TNF-α, IFN-γ), концентрацию IgА, IgМ, IgG в цервикальном секрете проводилось с использованием соответствующих тест-систем для иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин» Санкт-Петербург; ООО «Вектор-Бест», Новосибирск; «Hycult biotechnology», Нидерланды). Для исключения сопутствующих ИППП всем женщинам было проведено бактериологического исследования на наличие гонококков и трихомонад согласно методическим рекомендациям МЗ РФ «Стандартизация медицинской помощи больным гонококковой инфекцией» (Приказ №176 от 28.02.05), и положения МЗ РФ «О мерах по предупреждению распространения заболеваний, передающихся половым путём (Приказ № 291 от 30.07.01). Всем пациенткам был проведено количественное определение этих возбудителей с помощью тест-системы «Микоплазма-Дуо», установленный титр ≥104 КОЕ/мл, считался диагностически значимым. Культуральной диагностике предшествовало бактериоскопическое исследование материала из заднего свода влагалища и цервикального канала. Микроскопии подвергались окрашенные по Граму и метиленовым синим мазки. Определение грибов рода Candida проходило с использованием среды Сабуро и 5% кровяного агара. Диагностическим повышенным титром грибов рода Candida была концентрация 103 КОЕ/мл и выше. В качестве источника кавитационных ультразвуковых кавитационных воздействий низкой интенсивности был использован аппарат с частотой акустических колебаний на момент проведения терапевтических мероприятий 29 кГц, амплитуда колебаний 25 мкм. Курс лечения составил 10 ежедневных процедур длительностью 10 минут. Сеансы проводились в амбулаторных условиях, в специально оборудованном кабинете. Положение больной при проведении кавитационной терапии терапии- лёжа в гинекологическом кресле или на кушетке, на спине, ноги были согнуты в тазобедренных суставах и разведены. Процедура ультразвуковых орошений ультраозвученным раствором рекомбинантного IL-2 проводилась при помощи специальной разовой насадки. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» с вычислением средней арифметической и её стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистические процедуры, используемые для анализа качественных признаков, включали построение таблиц сопряженности с вычислением одностороннего точного критерия Фишера. Различия считали значимыми при р≤0,05. В зависимости от метода (с применением или без применения ультразвуковой кавитации) 120 женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, ассоциированных с генитальными микоплазмами (U.urealyticum+M. hominis) и грибами рода Candida, были разделены, по принципу адаптивной рандомизации, на группы, сопоставимые по возрасту (средний возраст 27,00±2,55 лет), отсутствию соматической патологии, клиническим проявлениям. Группу «Базис» составили 60 женщин, которым проводилась этиотропная терапия, включающая приём джозамицина по 500 мг 2 раза в сутки, дифлюкан по 150 мг однократно; Группа «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2» представлена 60 пациентками, которым наряду с базисными методами были предложены орошения шейки матки ультраозвученным раствором препарата рекомбинантного IL-2 по 500 тыс. ЕД разведенного в 100.0 мл 0,9% физиологического раствора. Шейка матки как точка приложения ультразвуковой кавитации выбрана с учётом того, что именно она, по мнению абсолютного большинства авторов является местом наибольшей иммунологической активности и наиболее частой локализации возбудителей воспалительных заболеваний урогенитального тракта [1, 2, 3, 4]. Воздействие производилось согласно методическим рекомендациям производителя аппарата ультразвуковой кавитационной терапии, генерирующего низкочастотное излучение после анализа, данных лабораторных исследований, купирования явлений интоксикации и исключения процессов в придатках матки, требующих оперативных вмешательств. Группа сравнения представлена 50 женщинами, отобранными при профилактических осмотрах в возрасте от 17 до 35 лет, не имевшими в анамнезе декомпенсированных системных заболеваний, ВИЧ инфекции, ИППП. В качестве материала для исследования был выбран цервикальный секрет, забор которого для проведения иммунологических исследований осуществлялся до лечения и через 4 недели после его окончания. Контроль элиминации возбудителя проводился методом ПЦР через 4 недели и через 8 недель после завершения лечения. Результаты и их обсуждение Сбор клинико-анамнестических данных показал, что пациенток, с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванными уреамикоплазмами и грибами рода Candida, беспокоили боли внизу живота (у 34%), зуд половых органов умеренной интенсивности отмечали 98% женщин, рези при мочеиспускании были у 79% инфицированных. Патологические выделения были у 100% инфицированных микоплазмами женщин, количество их было умеренным, по характеру выделялись гнойные, мутные и слизистые выделения. После окончания терапии с использованием ультразвуковой кавитационной и цитокинотерапии жалобы предъявляли лишь 2,8% пациенток по сравнению с группой, получавших базисное лечение, различные жалобы нна момент завершения лечения оставались у 12,7%. В группе больных, в комплекс мероприятий которым было включёно орошение воспалительного очага ультраозвученным раствором препарата Ронколейкин®, клиническое выздоровление и эрадикация микоплазм наступила в 99,15 % случаев, тогда как у пациенток, пролеченных по базисной схеме клиническое выздоровление наступило в 91,23 % случаев. По нашим предположениям это связано с тем, что по мере освобождения организма от патогена остаётся больше возможностей для активации системы местного иммунитета репродуктивного тракта [2, 6]. Полученные результаты позволяют рассматривать терапию низкочастотной ультразвуковой кавитацией и локальную иммунотерапию препаратом рекомбинантного IL-2 по 500 тыс. ЕД разведенного в 100.0 мл 0,9% физиологического раствора в качестве метода повышения неспецифической резистентности репродуктивного тракта. Для оценки иммунологической эффективности применения ультраозвученного раствора препарата рекомбинантного IL-2 по 500 тыс. ЕД разведенного в 100.0 мл 0,9% физиологического раствора в комплексной терапии генитальных микоплазмозов сочетанных с кандидозной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта сравнивали показатели факторов врождённого иммунитета цервикального секрета у больных, получавших терапию с использованием ультразвуковых воздействий и леченых по базисной схеме (табл.1). До начала терапии у женщин с микоплазменной инфекцией отмечена дисфункция клеточных факторов местной противоинфекционной защиты, выраженная в увеличении количества лейкоцитов в цервикальном секрете, повышении % жизнеспособных нейтрофилов, усилении лизосомальной активности, кислородозависимого метаболизма по НСТ-тесту, снижении функционального резерва, активности и интенсивности фагоцитоза нейтрофильных гранулоцитов слизи. Выявленный дисбаланс в состоянии клеточных факторов местной антимикробной защиты может служить основанием для включения в комплексную терапию микоплазменной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта локальной ультразвуковой кавитации с учётом параметров воздействия, предложенных производителем аппарата. При включении в схему лечения ультразвуковых кавитационных воздействий на шейку матки ультраозвученным раствором рекомбинантного IL-2 по 500 тыс. ЕД разведенного в 100.0 мл 0,9% физиологического раствора нами было выявлено снижение числа лейкоцитов с 11,61±0,59х109 до 6,38±0,3х109, количества жизнеспособных нейтрофилов с 7,61±0,50% до 3,92±0,20%. После окончания лечения с использованием ультразвука низкой частоты выявлено снижение лизосомальной активности нейтрофилов в цервикальном секрете по отношению к показателям до начала терапии с 66,10±2,39% до 18,67±1,30%. Учитывая преобладание в цервикальной слизи нейтрофилов, обеспечивающих микробоцидные свойства секрета, нами была изучена их бактерицидная функция по НСТ-тесту. В группе «Базис» уровень спонтанной НСТ-редуцирующей активности составил 34,72±1,33%, что оказалось на 17% выше показателя здоровых женщин - 28,72±1,40%. У пациенток, получавших терапию с применением ультразвука низкой интенсивности и раствором препарата рекомбинантного IL-2 по 500 тыс. ЕД разведенного в 100.0 мл 0,9% физиологического раствора отмечалась нормализация спонтанной НСТ-редуцирующей активности нейтрофилов цервикального секрета 29,72±1,40% на момент окончания лечения. Применение локальных ультразвуковых кавитационных воздействий в комплексе с цитокинотерапией способствовало восстановлению активности и интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, восстановлению лизосомальной активности фагоцитов цервикального секрета. После завершения терапии, в группе «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2», активность фагоцитоза составила 52,21±1,74% и достоверно не отличалась от показателей в группе здоровых женщин -53,44±1,7% , аналогичная позитивная динамика была выявлена при изучении активности и интенсивности лизосом нейтрофилов шеечного секрета. У пациенток с генитальной микоплазменной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта, пролеченных по базисной методике, отмечено нарастание локальных иммунологических расстройств к моменту проведения контрольного исследования (табл.1) Таблица 1 Состояние клеточных факторов цервикального секрета у женщин с сочетанной кандидозно-микоплазменной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта при различных способах терапии (М±m). Показатели Здоровые n=50 Базис n=60 «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2» n=60 До лечения После лечения До лечения После лечения Лейкоциты, x109 /л 6,33±0,29 11,55±0,59* 9,23±0,27 11,61±0,59* 6,38±0,30*** Лейкоциты жизнеспособные, (абс.) x109 3,99±0,28 7,41±0,34* 5,9±0,17 7,61 ± 0,50* 3,92±0,2*** Лейкоциты жизнеспособные,% 59,44±2,79 62,4±1,55* 60,1±2,2 63,52±1,70* 58,1±2,6*** Лизосомальная активность нейтрофилов, % 18,24±1,4 66,0±2,3* 30,6±1,12** 66,10±2,39* 18,67±1,30** Лизосомальная активность нейтрофилов, у.е. 29,4±2,56 155,5±22,0* 45,4±2,12** 145,5±22,0* 37,4±2,50*** Активность фагоцитоза нейтрофилов, % 53,44±1,7 37,9±1,71* 47,12±1,74 39,9±1,71* 52,21±1,74*** Интенсивность фагоцитоза нейтрофилов 2,25±0,16 1,57±0,03* 1,99±0,74 1,50±0,08* 2,29±1,12*** НСТ-тест спонтанный, % 28,72±1,40 49,33±2,0* 34,72±1,33** 49,7±2,0* 29,72±1,40*** НСТ-тест спонтанный, у.е. 0,33±0,02 0,75±0,04* 0,37±0,02** 0,77±0,04* 0,35±0,02*** НСТ-тест индуцированный, % 52,52±1,9 62,8±2,0* 54,22±1,90 63,8±2,0* 53,52±1,90*** НСТ-тест индуцированный, у.е. 0,69±0,03 1,07±0,05* 0,75±0,04** 1,09±0,05* 0,71±0,03*** ФРН 2,10±0,16 1,39±0,10* 1,41±0,16 1,42±0,10* 2,17±0,16*** Примечание здесь и в табл. 2,3: сравнения между группами проведены по критерию Мана-Уитни;*р<0,05 по отношению к показателям в группе здоровых**р<0,05 по отношению к показателям до лечения,***р<0,05 по отношению к показателям группы «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2» после лечения по отношению к группе «Базис» Гуморальные факторы местной противоинфекционной защиты были оценены по содержанию в секрете IL -1α, IL -8, TNF -α, IFN -γ, концентрации IgА, IgМ, IgG. Выявленная нами недостаточность IL -1α, TNF -α играющих важнейшую роль в реализации воспалительного ответа, в шеечном секрете инфицированных женщин может быть причиной выявленного нами снижения функциональной активности нейтрофилов цервикального секрета у инфицированных женщин. В процессе комплексной ультразвуковой терапии изучаемые показатели восстанавливались в полном объёме. Повышенная до начала лечения концентрация IL -8 после завершения лечения снизилась как в группе «Базис», так и в группе «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2», однако в последней процесс был более выраженным, что, по нашему мнению, могло бы быть связано с нормализацией количества нейтрофилов в очаге воспаления, как раз повлиявшей на снижение продукции IL-8. Сниженное до начала терапевтических мероприятий содержание IFN-γ после локальной ультразвуковой и цитокинотерапии раствором препарата Ронколейкин достоверно повышалось до 0,30±0,02 пг/мл. Изучение иммуноглобулинов в цервикальном секрете инфицированных женщин показало, достоверное повышение содержания IgА, наблюдаемое нами до начала лечения могло быть как следствием нарушения проницаемости слизистой оболочки шейки матки, так и активной продукцией антител в ответ на антигеннную стимуляцию лимфоидных структур под влиянием инфекционного агента, усиливающуюся при воспалительном процессе. После комплексной терапии с использованием ультразвуковой кавитации этот показатель нормализовался. Уровень Ig G в цервикальной слизи, повышенный до начала лечения нормализовался после терапии с применением ультразвука низкой частоты и составил 3,03±0,10 г/л. Достоверных различий по содержанию Ig M в цервикальном секрете женщин до и после лечения во всех сравниваемых группах не выявлено (табл. 2). Таблица 2 Состояние гуморальных факторов цервикального секрета у женщин с микоплазменной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта при различных способах терапии (М±m). Показатели Здоровые n=50 Базис n=60 «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2» n=60 До лечения После лечения До лечения После лечения Ig А, г/л 0,67 ± 0,08 1,99 ±0,2* 0,91±0,03** 1,81 ±0,2* 0,65 ±0,06*** Ig M, г/л 0,24 ± 0,03 0,23 ± 0,15 0,25 ± 0,02 0,30±0,2* 0,32 ± 0,01** Ig G, г/л 3,28 ± 0,3 5,40 ±0,78* 3,7 ± 0,2** 4,86±0,8* 3,03 ± 0,1*** IL -8, пг/мл 0,43±0,11 11,4±3,4* 5,44±0,1** 12,5±3,4* 4,47±0,11*** IFN -γ, пг/мл 0,03±0,003 0,012±0,001* 0,02±0,003** 0,01±0,001* 0,03±0,002*** IL -1α, пг/мл 3,31±0,21 0,17±0,03* 2,81±0,22** 0,2±0,05* 3,52±0,21*** TNF -α, пг/мл 19,22±1,53 1,43±0,41* 7,12±1,54** 1,4±0,51* 17,2±1,5*** Примечание: здесь и в табл. 2,3: сравнения между группами проведены по критерию Мана-Уитни;*р<0,05 по отношению к показателям в группе здоровых**р<0,05 по отношению к показателям до лечения,***р<0,05 по отношению к показателям группы «Базис+комплекс ультразвуковая кавитация и рекомбинантный IL-2» после лечения по отношению к группе «Базис». Выводы: 1. Включение низкочастотных ультразвуковых кавитационных воздействий в комплексе с цитокинотерапией в схему лечения женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванными уреамикоплазмами и грибами рода Candida способствует исчезновению большего числа клинических проявлений. 2. Применение рекомбинантного IL-2 с целью локальной иммунокоррекции при лечении генитального микоплазмоза, оказывает нормализующее действие на клеточные факторы местной противоинфекционной защиты цервикального секрета. Это выражается в снижении общего числа нейтрофилов, лизосомальной активности, нормализации их спонтанной и индуцированной НСТ-редуцирующей активности, функционального резерва нейтрофилов, повышении активности и интенсивности фагоцитоза этих клеток.

About the authors

Oksana Anatol'evna Gizinger

Email: OGizinger@gmail.com

I. I Dolgushin

References

Supplementary files