Оценка полиморфизма генов матриксной металлопротеиназы у больных с эндометриоидными кистами яичников

Полный текст

Введение

В настоящее время эндометриоз, поражающий до 10% женщин репродуктивного возраста, является одним из самых значимых заболеваний в гинекологии. С момента первого упоминания об этом заболевании C. Rokitansky в 1860 г. интерес ученых к эндометриозу, обусловленный значимостью данного процесса, привел к пониманию лишь отдельных звеньев патогенеза [1].

Большинство авторов многочисленных исследований, посвященных развитию эндометриоза, пришли к выводу, что генетические факторы играют существенную роль в предрасположенности организма к формированию заболевания [2]. Эндометриоз передается по наследству как сложный генетический признак, при котором взаимодействие нескольких локусов генов между собой и с окружающей средой вызывает фенотипическое заболевание [3]. Это означает, что генетическая предрасположенность к эндометриозу варьирует среди людей в общей популяции.

Современные представления об эндометриозе основываются на изучении комплекса молекулярно-биологических процессов, составляющих основу пролиферации, апоптоза, инвазии и неоангиогенеза [4]. Подобно процессу инвазии злокачественной опухоли, инвазия и ремоделирование внеклеточного матрикса клетками эктопического эндометрия являются необходимыми этапами в формировании эндометриоидных гетеротопий. По данным J. Guo и соавт. (2015 г.) [5], индекс инвазии клеток из очагов перитонеального эндометриоза был выше, чем из нормальных клеток эндометрия у женщин, не страдающих заболеванием.

Роль матриксных металлопротеиназ (ММР) в патогенезе генитального эндометриоза в настоящее время не вызывает сомнений, так как они вовлечены в инвазию гетеротопий в подлежащие ткани и неоангиогенез. По утверждению некоторых авторов [6], локальное повышение концентрации ММР способствует усилению адгезии и повышению инвазивной способности клеток эндометрия при ретроградной менструации, что поддерживает одну из концепций формирования эндометриоидных гетеротопий.

ММР представляют собой семейство внеклеточных цинксодержащих эндопептидаз, разрушающих базальные мембраны и внеклеточный матрикс при физиологических и патологических состояниях [7]. Некоторые из металлопротеиназ, такие как ММР-1, ММР-13, ММР-2, ММР-10, ММР-11, ММР-9, практически не экспрессируются в физиологических условиях. Увеличение уровня их экспрессии наблюдается при развитии патологического процесса (воспаление, опухолевый процесс, повреждение ткани и т.д.), и они начинают активно участвовать в этапах ремоделирования биологических структур [8].

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) – наиболее распространенная форма генетических изменений. Хорошо известно, что SNP в генах металлопротеиназ могут приводить к изменениям в их транскрипции и экспрессии и таким образом влиять на активность фермента [9]. Наиболее полиморфен ген ММР-9, кодирующий MMP-9 (желатиназу-B). Максимально исследован C>T-полиморфизм в промоторном регионе (rs3918242), связанный с разным уровнем транскрипции и ассоциированный с неопластическими процессами и неоангиогенезом. Замена цитозина (С) на тимидин (Т) нарушает сайт связывания с ядерными белками [10].

Цель исследования – анализ связи полиморфных сайтов гена ММР-9 с развитием наружного генитального эндометриоза.

Материалы и методы

В исследование включили 55 пациенток, которых разделили на 2 группы в зависимости от наличия или отсутствия эндометриоидных кист яичников (ЭКЯ). В 1-ю группу вошли 27 женщин, которым выполнили оперативное вмешательство по поводу ЭКЯ в отделении гинекологии НИИАП ФГБОУ ВО РостГМУ в период с 2018 по 2020 г. Во 2-ю (контрольную) группу включили 28 пациенток, прооперированных по поводу бесплодия трубного генеза и не страдающих эндометриозом.

У всех женщин исследовали SNP. Генотипирование осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Участки промоторных регионов генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров, затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле.

Материалы исследования подвергли статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Статистический анализ проводился с использованием программы IBM SPSS Statistics v.26 (разработчик IBM Corporation) и пакета Statistica 12.5.

Совокупности количественных показателей, распределение которых отличалось от нормального, описывались при помощи значений медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3).

Номинальные данные рассматривались с указанием абсолютных значений и процентных долей. Для сравнения независимых совокупностей в случаях отсутствия признаков нормального распределения данных использовался U-критерий Манна–Уитни.

Сопоставление номинальных данных проводилось при помощи критерия χ² Пирсона, позволяющего оценить значимость различий между фактическим количеством исходов или качественных характеристик выборки, попадающих в каждую категорию, и теоретическим количеством, которое можно ожидать в изучаемых группах при справедливости нулевой гипотезы.

Полученное значение точного критерия Фишера при р>0,05 свидетельствовало об отсутствии статистически значимых различий, р<0,05 – об их наличии.

Результаты и обсуждение

У всех пациенток 1-й группы отмечалось одностороннее поражение яичников. Эндометриомы диагностировали во время ультразвукового исследования, при этом размеры кист в среднем составили 4,25 (3,2; 6,3) см. Наличие ЭКЯ явилось показанием к оперативному вмешательству в объеме удаления кисты, разъединения спаек, при необходимости производилось иссечение очагов поверхностного эндометриоза. Согласно классификации Американского общества фертильности у 25 (93%) женщин во время лапароскопии диагностировали III стадию распространения эндометриоза, а у 2 (7%) – IV стадию тяжести исследуемого процесса.

Возраст исследуемых пациенток варьировал от 19 до 47 лет. Me возраста больных ЭКЯ 1-й группы составила 29,0 (25,95; 33,1) года и значимо не отличалась от Me возраста пациенток 2-й – 34,5 (29,3; 37,0) года (р>0,05); табл. 1, рис. 1.

 

Таблица 1. Распределение различных параметров пациенток в исследуемых группах / Table 1. Distribution of various patient parameters in the study groups

	Группа
	1-я (n=27)		2-я (n=28)
	Ме	95% ДИ	Ме	95% ДИ
Возраст, лет	29,0	25,95; 33,1	34,5	29,3; 37,0
ИМТ	21,2	19,8; 22,6	21,95	20,4; 23,9
Возраст наступления менархе	13,0	12,95;14,0	13,0	12,0; 14,0
Длительность менструального кровотечения, дни	5,0	5,0; 5,0	5,0	5,0; 6,0

ДИ – доверительный интервал.

 

Рис. 1. Распределение различных параметров пациенток в исследуемых группах. / Fig. 1. Distribution of various patient parameters in the study groups.

 

Проведенный анализ индекса массы тела (ИМТ) женщин, вошедших в исследование, показал, что значимых различий между анализируемыми группами не выявили. В 1-й группе Me показателя ИМТ составила 21,2 (19,8; 22,6), во 2-й – 21,95 (20,4; 23,9); см. табл. 1, рис. 1.

Такие параметры, как возраст наступления менархе и длительность менструального кровотечения, также вошли в оценку менструальной функции больных с ЭКЯ и пациенток контрольной группы. Проведенный анализ выявил, что возраст менархе у пациенток 1 и 2-й группы колебался от 10 до 17 лет, продолжительность менструального кровотечения составляла в среднем 5 дней (рис. 4), при этом статистически значимых различий Me этих показателей не отметили (р>0,05); см. табл. 1, рис. 1.

 

Рис. 4. ROC-кривая, отражающая прогностическую силу модели. / Fig. 4. ROC- curve that represents the predictive power of a model.

 

При анализе других показателей менструальной и репродуктивной функций у пациенток с ЭКЯ и женщин контрольной группы статистически значимые различия не обнаружили. Все рассматриваемые показатели представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Распределение различных параметров пациенток в исследуемых группах / Table 2. Distribution of various patient parameters in the study groups

Группа	Число	Аборты		Альгодисменорея		Роды				Время установления регулярного цикла
		нет	да	нет	да	нет	1	2	3	сразу	нет
1-я	27 (49,1%)	22	5	14	13	19	6	1	1	5	23
2-я	28 (50,9%)	17	11	14	14	13	10	2	3	4	23
χ2		2,822		0,019		3,441				0,091
p		0,0930		0,8918		0,3285				0,7626

 

Для оценки значимости различных вариантов генотипов в вероятности наступления определенного исхода применялся метод «Дерево решений» (рис. 2). В результате произведенных расчетов сделан вывод, что возникновение ЭКЯ возможно предположить у пациенток с генотипом СС и ИМТ>29,6 (узел 4 на рис. 2), а также у женщин в возрасте старше 22 лет с генотипом СС, ИМТ≤22,95 и длительностью менструального кровотечения менее 6,5 дня (узел 14 на рис. 2). Такой же вероятный исход можно ожидать у пациенток с генотипом СТ или ТТ, не страдающих альгодисменореей и имеющих длительность менструального кровотечения более 3,5 дня (узел 10 на рис. 2). Чувствительность и специфичность этого вывода составляет 81 и 96% соответственно.

 

Рис. 2. «Дерево решений» для классификации групп. / Fig. 2. "Decision tree" for classifying groups.

 

Узел 4

Генотип СС

ИМТ>29,6

 

Узел 14

Генотип СС

ИМТ≤29,6

Длительность менструального кровотечения <6,5 дня

Возраст >22 лет

 

Узел 10

Генотип СС или ТТ

Альгодисменорея = 0

Длительность менструального кровотечения >3,5 дня

 

При этом следует сделать вывод, что вариант генотипа имеет наименьшую значимость при определении возможности развития ЭКЯ (рис. 3).

 

Рис. 3. Нормализованная важность. / Fig. 3. Normalized importance.

 

Для оценки диагностической значимости номинальных признаков при прогнозировании определенного исхода, в том числе вероятности его наступления, рассчитанной с помощью «Дерева решений», применялся метод анализа ROC-кривых. Качество прогностической модели, полученной данным методом, оценивалось исходя из значения площади под ROC-кривой (АUC=0,924), что свидетельствует о высокой прогностической силе полученной модели (см. рис. 4).

Частоты всех исследованных авторами генотипов металлопротеиназы ММР-9 С(–1562)Т гена ММР-9 в группе пациенток с ЭКЯ и группе контроля находятся в равновесии Харди–Вайнберга (р=0,99 и 0,43 для 1 и 2-й группы соответственно); рис. 5.

 

Рис. 5. Диаграмма де Финетти, отражающая равновесие Харди–Вайнберга. / Fig. 5. De Finetti diagram that reflects Hardy- Weinberg equilibrium.

 

Заключение

MMP-9 является важным ферментом в процессе деградации базальной мембраны, в первую очередь коллагена IV типа и желатинов, а также обладает протеолитической активностью в отношении протеогликанового ядра и эластина [11]. Предыдущие эксперименты показали, что MMP-9 в эктопическом эндометрии значительно выше, чем в эутопическом [12, 13]. Эта повышенная экспрессия может быть одной из причин инвазивных свойств эндометрия, приводящих к развитию эндометриоза [12, 13].

В настоящее время не существует единого мнения о роли генов ММР в патогенезе эндометриоза. По мнению одних авторов, ассоциация полиморфных вариантов этих генов выявляется с развитием наружного генитального эндометриоза [14], другие же исследователи категорически ее отрицают [15].

Недавно идентифицировали несколько полиморфизмов в гене MMP-9. Сообщалось о замене C>T в положении -1562 перед сайтом инициации транскрипции MMP-9 [16]. Исследования in vitro показали, что варианты -1562T MMP-9 ассоциированы с повышенной активностью промотора за счет потери сайта связывания белка-репрессора транскрипции.

В результате исследования авторы не выявили различия в распределении частот генотипов полиморфных локусов генов MMP-9 в группе пациенток с ЭКЯ и контрольной группе.

Большой метаанализ 2016 г. [2] также показал отсутствие значимой связи между полиморфизмом MMP-9(-1562)C>T (rs3918242) и риском развития эндометриоза в общей популяции. Однако, по результатам работы M. Saare и соавт. [17], выявлена значимая связь между частотой генотипов T/T или T/C и стадиями эндометриоза (в частности, III и IV) у европеоидов. Это позволяет предположить, что такие факторы, как тяжесть заболевания, популяционные различия, численность исследуемых групп могут быть причинами расхождений между исследованиями.

Роль ММР в патогенезе генитального эндометриоза не вызывает сомнений. Известно, что MMPs вовлечены в два наиболее сложных этапа развития эндометриоидных гетеротопий: инвазию клеток в подлежащие ткани и неоангиогенез. По мнению авторов статьи, необходимо проводить дальнейшие исследования с более крупными выборками в различных популяциях для выявления роли полиморфизма MMP-9 в риске развития различных форм эндометриоза, а также с целью прогнозирования тяжести заболевания.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Об авторах

Светлана Олеговна Дубровина

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: s.dubrovina@gmail.com

д-р мед. наук, проф., гл. науч. сотр. НИИАП

Россия, Ростов-на-Дону

Юлия Дмитриевна Берлим

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: juliaberlim@yandex.ru

канд. мед. наук, зав. консультативно-поликлиническим отд-нием

Россия, Ростов-на-Дону

Марина Ахмедовна Вовкочина

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: jordan-85@inbox.ru

врач акушер-гинеколог гинекологического отд-ния НИИАП

Россия, Ростов-на-Дону

Сергей Викторович Морданов

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: Labmed@mail.ru

канд. мед. наук, зав. лабораторным отд. медико-генетического центра

Россия, Ростов-на-Дону

Анна Дмитриевна Александрина

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: anna221215@inbox.ru

врач акушер-гинеколог

Россия, Ростов-на-Дону

Список литературы

Дополнительные файлы