Species diversity and photobiont localization specificities in epigene lichens (on the example of the genus Cladonia)

Full Text

Введение

Лишайники согласно классическому определению – это симбиотические организмы, существующие в результате мутуалистического взаимодействия гетеротрофного (грибного) и фототрофного (водоросли или цианобактерии) компонентов. В некоторых источниках лишайниковый симбиоз рассматривается как паразитизм гриба на водоросли. Несмотря на давнюю историю исследований лишайников особенности динамики численности и таксономической структуры населяющих их микроорганизмов не были предметом пристального изучения. Только в последние два десятилетия, в связи с развитием молекулярно-биологических методов исследований удалось обнаружить в лишайниках не только микобионт и фотобионт, но также и целый комплекс сопутствующих видов грибов, водорослей, а также бактериосимбионтов и простейших (Т.А. Панкратов и др. [1]). Некоторые особенности распределения и таксономической структуры бактерий и грибов в лишайниках исследованы зарубежными [2; 3] и российскими исследователями [4–6]. Хотя данные о таксономическом составе фотобионтов в талломах неплохо представлены в научных публикациях [7], количественных данных об их распределении внутри талломов в литературе почти нет.

Целью работы было изучение таксономического состава и численности водорослей в талломах лишайников, собранных на территории Беломорской биостанции (ББС) МГУ, в горном массиве Хибины (Мурманская область) и в Оренбургской области. Особое внимание было уделено исследованию динамики изменения состава и численности клеток водорослей в зависимости от возраста таллома. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1) провести идентификацию водорослей в растущей (верхушечной) и деградирующей (нижней) частях подециев эпигейных лишайников рода Cladonia; 2) установить численность морфотипов (видов) в подециях в зависимости от их локализации; 3) сравнить данные о таксономическом составе и численности водорослей в лишайниках северотаёжной и степной зон; 4) выделить в чистые культуры водоросли идентифицированных видов и попытаться провести ресинтез лишайников.

Материалы и методы исследования

Для анализа были отобраны образцы эпигейных лишайников следующих видов: Cladonia arbuscula (Wallr.) Flot. ssp. arbuscula, C. stellaris (Opiz.) Brodo (Cladonia alpestris (L.) Rabenh.), C. rangiferina (L.) Weber ex F.H. Wigg., которые произрастали в хвойных сообществах Мурманской области и Хибинах (ельники), и Оренбургской области (сосняки на территории национального парка «Бузулукский бор»). Все три вида относятся к кустистым кустисто-разветвлённым [8–11].

Образцы лишайников сразу же после сбора высушивали, затем до проведения экспериментов хранили в холодильнике при температуре +5°С. Далее образцы гомогенизировали растиранием в фарфоровой ступке или с использованием гомогенизатора IKA Ultra-Turrax Tube Drive аналогично применённой ранее методике [6]. Учёт численности проводили в 30-ти полях зрения при увеличении ×1000 на микроскопах Микмед-6 и Микромед 3 ЛЮМ. Выделение водорослей в чистые культуры проводили с использованием гомогенатов подециев. Культивировали на среде ВВM [12] при температуре +15°С и освещённости 3500 лк. Определение фотобионтов проводили по определителям [13; 14].

Для выявления необходимых для лишайникового симбиоза фотобионтов проводили следующий эксперимент. На плотную среду Кнопа с долей агара 2% наносили в стерильных условиях чистую культуру микобионта в четырёх местах на чашки Петри. Затем туда же добавляли культуру фотобионта в следующих сочетаниях: Chlorella sp.; Chlorella sp. + Asterochloris sp.; Chlorella sp. + Asterochloris sp. + Stichococcus sp. Данный эксперимент проводили в пятикратной повторности с Cladonia arbuscula и C. stellaris. В первые четыре месяца эксперимента осуществляли еженедельный полив стерильной водой по 1 капле.

Статистическая обработка результатов была произведена с помощью Microsoft Excel 2010.

Результаты исследований и их обсуждение

Анализ тотальных гомогенатов лишайников показал наличие в них четырёх основных морфотипов клеток водорослей, три из которых были идентифицированы на основании морфологических и культуральных характеристик (рис. 1). Попытки изолировать эти водоросли в чистые культуры привели к выделению в аксенически чистую культуру только водорослей рода Pseudococcomyxa, тогда как Chlorella, Stichococcus и Asterochloris очистить от бактериальных спутников не удалось.

Главная закономерность, которая прослеживалась во всех видах лишайников обеих географических зон – доминирование водорослей рода Asterochloris в верхушечной, активно растущей зоне подециев. Особенно хорошо это заметно в лишайниках из степной зоны, в частности C. arbuscula (рис. 2), в которых численность клеток водорослей этого рода достигала уровня 6·10⁷ кл/г, в то время как в северотаёжных лишайниках численность была не выше 3·10⁷ кл/г. Это можно объяснить более высокими потребностями микобионта в органических веществах на фоне значительно более высоких температур вегетационного периода, а также значительным уровнем инсоляции в степной зоне.

При анализе количественных данных в лишайниках северотаёжной зоны выявлена закономерность: доминирование водорослей Asterochloris в верхушечной части лишайников С. arbuscula, C. rangiferina и C. stellaris сменяется равномерным распределением клеток двух видов фотобионтов, а в стареющих частях и на стадии разложения таллома начинают доминировать водоросли рода Pseudococcomyxa. Недавно водоросли рода Pseudococcomyxa и Stichococcus были обнаружены в почве Мурманской области под лишайниками рода Cladonia [15].

 

Рисунок 1 – Микрофотографии культур фотобионтов из лишайника Cladonia arbuscula, произрастающего в Оренбургской области: А – Asterochloris sp.; Б – Chlorella sp.; В – Stichococcus sp. Увеличение ×280 (А), ×400 (Б, В)

 

Рисунок 2 – Число клеток водорослей разных функциональных зон эпигейного лишайника Cladonia arbuscula, произрастающего в разных природных зонах

 

Наличие неидентифицированной водоросли в составе разных участков талломов лишайников обеих географических зон (рис. 2) указывает на вероятную зависимость активности этого морфотипа от климатических условий. В степной зоне он проявляет себя как один из компонентов активно растущего таллома, а в северотаёжной субарктической – как компонент микробного сообщества лишайника на стадии его деградации. Полученные нами данные на основании прямого анализа с помощью световой микроскопии диссонируют с таковыми, полученными P. Moya [16] в 2017 году методом анализа геномной ДНК, выделенной из лишайника R. farinacea. Авторы этой публикации обнаружили увеличение численности OTU (операционных таксономических единиц), принадлежащих Asterochloris spp. и прочим зелёным водорослям от апикальной к базальной части таллома. И напротив, количество OTU, относящихся к Trebouxia spp. снижалось. Отличие в полученных результатах может быть объяснено как применением разных методов оценки численности, а также видовой и экологической разницей изучаемых лишайников. Лишайники рода Ramalina – в основном эпифитные, растущие на коре деревьев, тогда как представители рода Cladonia – это, главным образом, эпигейные виды, нижняя часть подециев которых взаимодействует с субстратом (как правило, почвой). К сожалению, в научной литературе отсутствуют сведения о молекулярно-генетическом анализе данных о распределении водорослей в лишайниках рода Cladonia, что не позволяет провести сравнения наших результатов с данными других исследователей. Кроме того, только в одной статье [17] приведены различия географического характера для лишайников Индии и Непала. Однако в этой публикации рассматриваются только водоросли рода Asterochloris.

Существует и ещё один аспект: характер расположения микроколоний водорослей в лишайнике. Не исключено, что вторичные виды водорослей локализованы не в слое фотобионта лишайников, а на поверхности талломов, в микролокусах, не отделяющихся полностью от таллома при промывке проточной водой. Поэтому роль их как истинных фотобионтов можно поставить под сомнение.

В изученной литературе нет данных о способе подготовки материалов для анализа. Возможно, что выделение геномной ДНК и приготовление тотальных препаратов гомогенатов для оптической микроскопии проводилось без предварительной отмывки талломов. В нашей работе метод гомогенизации в фарфоровой ступке был дополнен более сложным способом подготовки образца: мы провели предварительную отмывку талломов лишайников C. rangiferina и C. arbuscula из Оренбургской и Мурманской областей с использованием вортекса Multi Reax (Heidolph, Германия). Последующую промывку проводили методом прессования в шприце, снабжённом фильтрующим ватным диском, с трёхкратной промывкой фосфатным буфером. Затем промытый и измельчённый таллом гомогенизировали до однородной суспензии с использованием гомогенизатора IKA Ultra-Turrax Tube Drive. Полученные данные приведены на рисунке 3.

Для гомогенатов отмытых талломов в целом характерна сходная динамика изменения численности Asterochloris, как и в случае растирания талломов в ступке. Однако выявлена несколько бóльшая численность этого фотобионта в растущих частях С. arbuscula – 2·10⁸ кл/г, что можно связать с механическим повреждением крупных клеток в процессе растирания, в отличие от более мягкого метода роторной гомогенизации. В апикальной зоне C. rangiferina число клеток Asterochloris было около 5,5·10⁷ кл/г. В отличие от первого метода, в отмытых гомогенатах степных лишайников численность водорослей-спутников была ниже, достигая значений 10⁶ кл/г. В зрелой (серединной) зоне подециев численность основного фотобионта снижалась почти на порядок, в базальной части доходила до 3·10⁷ кл/г в C. rangiferina и 9·10⁶ кл/г в C. arbuscula. В смывах с талломов данных лишайников живых водорослей рода Asterochloris не было обнаружено, но встречались клетки других водорослей. Также наличие оболочек клеток основного фотобионта в смывах может свидетельствовать об их присутствии на поверхности талломов, где их жизнеспособность теряется.

Динамика изменения численности фотобионтов в образцах лишайников из Мурманской области, Хибин и Оренбургской области в целом остается такой же. Наименьшая абсолютная численность Asterochloris минимальна в образцах лишайника C. arbuscula, отобранных на территории ББС МГУ (сфагновое болото), а максимальна – в образцах из Бузулукского бора, средние значения демонстрируют образцы, собранные в горных экосистемах Хибин (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Динамика изменения численности фотобионта рода Asterochloris в лишайниках C. arbuscula (CA) Оренбургской области (OR), Хибин (KH) и Биологической станции МГУ (Мурманская область) (B); C. rangiferina (CR) и C. stellaris (CS): 1 – верхушка, 2 – середина, 3 – базальная часть подециев

 

В ряде образцов лишайников из Мурманского региона в гомогенатах верхушечных частей C. rangiferina наряду с главным фотобионтом присутствовали клетки Pseudococcomyxa. Количество этих клеток увеличивалось пропорционально степени деструкции таллома (данные не показаны).

В смывах с поверхности талломов всех изученных образцов лишайников были найдены единичные клетки Asterochloris, Stichococcus, Pseudococcomyxa и Chlorella, их численность не превышала 10⁴ кл/г.

Интерпретация полученных количественных данных на данном этапе исследований вызывает затруднения. Однако можно с уверенностью говорить, что в молодых (апикальных) зонах подециев эпигейных лишайников рода Cladonia интенсивность размножения водорослей Asterochloris обусловлена большей физиологической активностью микобионта, так как объяснить полученные результаты с позиций интенсивности минерального питания сложно. Кроме того, у нас уже имеются данные о присутствии в талломах лишайников эндофитных бактерий, большая часть которых принадлежит порядку Rhizobiales. Среди бактерий этого порядка присутствуют и виды, способные к азотфиксации. Ряд выделенных из лишайников микроорганизмов способны солюбилизировать фосфаты.

Также нами была предпринята попытка совместить ранее полученные чистые культуры микобионта и фотобионта лишайников C. arbuscula и C. stellaris для ресинтеза талломов. В лабораторных условиях водоросли рода Asterochloris более активно развивались при температуре +15°С, в то время как другие зелёные водоросли лучше росли при более высоких температурах.

Первая серия экспериментов проведена с микобионтом Cladonia stellaris. Оказалось, что при выбранных условиях культивирования клетки водорослей росли намного лучше, чем мицелий микобионта, образуя пятна по размеру растекающейся капли при еженедельном увлажнении и толщиной до 1 мм.

Микроскопия всех вариантов эксперимента с тремя видами водорослей через 6,5 месяцев показала доминирование Stichococcus sp., образующий цепочки из трёх клеток длиной до 12,5 мкм при толщине 2,5 мкм, но иногда встречались клетки Asterochloris sp. и Chorella sp. Следовательно, именно Stichococcus sp. является in vitro более конкурентоспособным среди остальных видов водорослей. Возможно, ему помогает занять лидирующее положение обильная слизистая оболочка, во много раз превышающая его размеры, что способствует вытеснению других видов.

Культура Stichococcus sp. из-за продуцируемой ею слизи обволакивала чешуйки микобионта и препятствовала другим видам фотобионта вступить в контакт с грибом. Однако в одной из чашек был обнаружен образец, где на чешуйках микобионта ещё сохранились скопления клеток Asterochloris sp., находившиеся, однако, в угнетённом состоянии размером до 7,5 мкм. В этом же образце с Asterochloris наблюдалось ветвление чешуек микобионта беловатого цвета, растущее вверх как подеций (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Чешуйки микобионта Cladonia alpestris: А – Asterochloris sp. на чешуйках; Б – ветвление чешуек, напоминающее подеций (×14)

 

Эксперименты с Cladonia arbuscula показали сходные результаты. Также отмечено преобладание во всех вариантах Stichococcus sp. и Chlorella sp., которые практически полностью вытеснили Asterochloris sp. Скорее всего, для воссоздания in vitro лишайникового симбиоза необходимы водоросли рода Asterochloris и микобионт, а также какие-то специфические факторы регуляции этого процесса. Подтверждением этой гипотезы служат литературные данные, в которых у лишайников рода Cladonia обнаруживается только один род фотобионта – Asterochloris [18–21]. Возможно, выявленные нами Chlorella sp. и Stichococcus sp. располагаются в разных функциональных зонах лишайника, предположительно в нижней части подециев. Об этом косвенно указывают результаты Патрисии Мойя с сотрудниками [16]. Их роль как фотобионтов пока трудно подтвердить, так как прямые исследования показывают их вторичное распространение в талломах исследованных лишайников. Доказательство их «фотобионтных» свойств можно получить только в процессе успешного моделирования (ресинтеза) лишайника с участием этих родов водорослей.

About the authors

Evgene Sergeevich Korchikov

Samara National Research University

Email: evkor@inbox.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Ecology, Botany and Nature Protection Department

Russian Federation, Samara

Egor Vladimirovich Bolgov

Samara National Research University

Email: egrk.krge@gmail.com

student of Biology Faculty

Russian Federation, Samara

Elena Sergeevna Ilyina

Samara National Research University

Email: ilinahelen@mail.ru

student of Biology Faculty

Russian Federation, Samara

Timofey Anatolyevich Pankratov

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: tpankratov@mail.ru

candidate of biological sciences, project supervisor, Soil Biology Department

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files