Oil-oxidation properties of  Micrococcus  bacteria isolated from the Nakhodka Bay seawater of the Sea of Japan

Julia Sergeevna Golozubova; Голозубова Юлия Сергеевна; Lyubov Stepanovna Buzoleva; Бузолева Любовь Степановна; Elena Aleksandrovna Bogatyrenko; Богатыренко Елена Александровна; Alexandra Vyacheslavovna Kim; Ким Александра Вячеславовна; Alena Igorevna Eskova; Еськова Алена Игоревна

doi:10.17816/snv201872101

Oil-oxidation properties of Micrococcus bacteria isolated from the Nakhodka Bay seawater of the Sea of Japan

Authors: Golozubova J.S.¹, Buzoleva L.S.¹, Bogatyrenko E.A.¹, Kim A.V.¹, Eskova A.I.¹
Affiliations:
1. Far Eastern Federal University
Issue: Vol 7, No 2 (2018)
Pages: 13-16
Section: 03.02.00 – General Biology
URL: https://snv63.ru/2309-4370/article/view/21700
DOI: https://doi.org/10.17816/snv201872101
ID: 21700

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

This paper shows the oil-oxidizing ability of Micrococcus bacteria isolated from the Nakhodka Bay surface waters of the Peter the Great Gulf, the Sea of Japan. Micrococcus Bacteria are known to be the most active destructors of petroleum hydrocarbons in natural biotopes, contaminated objects. Voroshilova-Dianova liquid containing 2,5% oil or oil products was introduced into sterile penicillin bottles with 105 cells of the investigated bacteria. The ability to destruct petroleum hydrocarbons by bacteria of this genus was studied using a gravimetric method during 30 days. Destruction of oil, gasoline, fuel oil and diesel fuel was shown. Micrococcus bacteria showed a high oil-oxidizing ability and decompose 65–99,9% of oil and oil products within 30 days. Gasoline was the source of petroleum hydrocarbons with the greatest ability to utilize this genus of bacteria. The destruction of this hydrocarbons source by bacteria on days 15–20 was about 99% of the initial concentration. The lowest ability of destruction by Micrococcus bacteria was revealed for diesel fuel.

Keywords

oil-oxidizing bacteria, Micrococcus sp., fuel oil, petrol, oil, diesel fuel, Nakhodka bay, anthropogenic pollution, marine microorganisms, ecological monitoring, the Sea of Japan, the Gulf of Peter the Great, gravimetric method, destruction of petroleum hydrocarbons

Full Text

Актуальность исследований

В прибрежных акваториях залива Петра Великого вблизи крупных городов вследствие выбросов неочищенных бытовых отходов и судоходства традиционно отмечается повышенное содержание нефти и нефтепродуктов [1–3]. Одним из наиболее перспективных способов ликвидации загрязнения морей является биоремедиация, представляющая собой совокупность методов очистки окружающей среды за счет биохимической активности различных живых объектов, в том числе морских микроорганизмов и микроорганизмов нефтяных залежей [4; 5].

Экологическое значение бактерий как разрушителей углеводородов нефти в море очень велико, так как известно, что более высокоорганизованные формы организмов не могут осуществлять их полную деструкцию. В прибрежной зоне, постоянно загрязняющейся нефтью и нефтепродуктами, формируются специфические сообщества гетеротрофных микроорганизмов, которые обладают способностью окислять широкий спектр углеводородов и продуктов их трансформации [6]. В настоящее время описано 70 родов углеводородоокисляющих микроорганизмов, из них 28 родов бактерий, 30 родов мицелиальных грибов и 12 родов дрожжей [7]. Бактерии рода Microccoccus известны как деструкторы нефтепродуктов в естественных биотопах загрязненных объектов [8].

Бухта Находка залива Петра Великого испытывает сильное нефтяное загрязнение [9–11]. В 2016 г. в бухте Находка в 70,8% проб концентрация нефтеуглеводородов была выше предельно допустимого значения [12]. К настоящему времени большинство микробиологических исследований бухты Находка рассматривают только сезонную изменчивость ОМЧ гетеротрофных бактерий, физиолого-трофических групп, в том числе нефтеокислящих бактерий [13; 14]. Таким образом, целью работы стало изучение нефтеокисляющих свойств бактерий рода Micrococcus, выделенных из бухты Находка Японского моря, утилизировать нефтеуглеводороды, такие как дизельное топливо, нефть, мазут и технический бензин.

Материал и методы исследований

Штаммы бактерий рода Micrococcus (Н1, Н2) были получены из проб морской воды бухты Находка залива Петра Великого (Японское море). Материалом для исследования послужили пробы поверхностных вод бухты, отобранные в августе 2015 г. (рис. 1). Пробы морской воды отбирались шприцем на глубине 15–20 см в пластиковый шприц (V = 20 мл) и обрабатывались в течение 3–6 часов. Посев проб воды производился методом последовательных разведений с высевом на поверхность среды Ворошиловой – Диановой с добавлением 2,5% нефти и нефтепродуктов [15; 16]. Инкубировали в течение 2 суток при комнатной температуре. Следующим этапом работы стало изучение фенотипических свойств полученных бактериальных изолятов. Морфологию клеток и колоний, подвижность, наличие спорообразования, физиолого-биохимические признаки, окраску по Граму, культуральные свойства учитывали в соответствии с классическими микробиологическими методами [17]. Идентификацию Micrococcus sp. проводили с помощью определителя Берджи [18].

Рисунок 1 – Карта-схема района исследования – бухта Находка Залива Петра Великого (Японское море)

Для изучения углеводородокисляющей способности штаммов Micrococcus sp. Н1 и Н2 клетки бактерий в концентрации 10⁵ КОЕ/мл инокулировали в стерильные пенициллиновые флаконы с жидкой средой Ворошиловой – Диановой с добавлением 2,5% нефти или нефтепродуктов [15; 16]. Для получения достоверных результатов учитывали процент естественных потерь нефтеуглеводородов за счет окисления, не связанных с деятельностью микроорганизмов. В качестве контроля была использована жидкая среда Ворошиловой – Диановой с добавлением 2,5% нефти или нефтепродуктов без добавления суспензии с микроорганизмами. Все опыты повторяли трижды. Изучение способности разлагать нефтеуглеводороды проводили c помощью гравиметрического метода в течение 30 суток [19]. Статистическую обработку проводили с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [20]. Об изменении численности клеток бактерий судили по изменению оптической плотности опытных растворов. Измерения проводили при длине волны 540 нм на спектрофотометре UV-1800 SHIMADZU.

Результаты исследований и их обсуждение

Бактерии рода Micrococcus продемонстрировали высокую нефтеокисляющую способность, разложив 65–99% нефти и нефтепродуктов через 30 суток. Было показано, что источником нефтеуглеводородов с наибольшей способностью к утилизации исследуемыми бактериями являлся бензин. Деструкция данного нефтепродукта бактериями на 30 сутки составляла около 99% от начальной концентрации. Наименьшая способность разложения бактериями рода Micrococcus была выявлена для дизельного топлива. Скорость деструкции нефтеуглеводородов бактериями рода Micrococcus является штаммоспецифичной с сохранением высокой степени деструкции нефтеуглеводородов (табл. 1).

Таблица 1 – Способность штаммов Micrococcus sp. (Н1, Н2) к окислению дизельного топлива, нефти, бензина и мазута на 30 сутки

Вид субстрата	Начальная концентрация субстрата, г/дм³	Н1		Н2
Вид субстрата	Начальная концентрация субстрата, г/дм³	Конечная концентрация нефтепродукта, г/дм³	Степень деструкции, %	Конечная концентрация нефтепродукта, г/дм³	Степень деструкции, %
Нефть	21,98 ± 0,01	2,36 ± 0,01	89,26	7,8 ± 0,01	65
Дизельное топливо	23,04 ± 0,02	4,68 ± 0,02	79,69	2,58 ± 0,03	88,8
Мазут	34,46 ± 0,03	2,72 ± 0,04	92,11	9,18 ± 0,02	73,3
Бензин	15,98 ± 0,01	0,14 ± 0,01	99,9	0,02 ± 0,01	99,9

Примечание. Показатели M ± m; * различия статистически значимы по отношению к контролю (p < 0,05).

Наиболее эффективно разложение бензина происходит в первые дни их взаимодействия с микроорганизмами рода Micrococcus. На 15–20-е сутки бактерии разложили бензин практически полностью, а дальнейший рост их численности обусловлен утилизацией продуктов распада нефтеуглеводородов (органических кислот, спиртов, альдегидов и т.п.) (табл. 2).

Таблица 2 – Оптическая плотность штаммов Micrococcus sp. (Н1, Н2) и степень деструкции бензина на различные сутки эксперимента

Сутки эксперимента	Н1		Н2
Сутки эксперимента	Оптическая плотность бактерий	Степень деструкции бензина, %	Оптическая плотность бактерий	Степень деструкции бензина, %
5 сутки	0,020 ± 0,003	98,25	0,030 ± 0,006	75,00
10 сутки	0,050 ± 0,002	98,87	0,070 ± 0,004	83,73
15 сутки	0,070 ± 0,004	98,87	0,100 ± 0,003	99,50
20 сутки	0,100 ± 0,003	99,00	0,157 ± 0,004	99,62
25 сутки	0,185 ± 0,001	99,9	0,310 ± 0,007	99,9
30 сутки	0,180 ± 0,002	99,9	0,300 ± 0,001	99,9

Примечание. Показатели M ± m; * различия статистически значимы по отношению к контролю (p < 0,05).