Influence of temperature and carbon sources on auxin biosynthesis by Rhodococcus erythropolis strain and their phytostimulating activity in urbanozem soil

Full Text

В настоящее время существует тенденция к росту антропогенного влияния на экосистемы. К наиболее распространённым поллютантам относятся нефтяные, полициклические ароматические, галогенированые углеводороды, пестициды, растворители, тяжелые металлы и их соли. Попадая во внешнюю среду, они способны негативно влиять на состояние здоровья людей [1]. Одной из перспективных технологи очистки антропогенно нарушенных почв является технология ризоремедиации [2], суть которой сводится к совместному использованию потенциала бактерий и растений для снижения уровня токсических органических соединений во внешней среде [3]. К настоящему моменту известно, что основную роль в окислении поллютантов выполняет микрофлора ризосферы, обладающая ростстимулирующими свойствами – например, способностью к фиксации атмосферного азота, растворению неорганических фосфатных солей, синтезу сидерофоров и фитогормонов. Группа бактерий, обладающая данными качествами, получила название PGPR (plant growth promoting rhizobacteria). Как правило, данные микроорганизмы не обладают способностью разрушать устойчивые органические поллютанты, поэтому для реализации технологии ризоремедиации разрабатывают либо генетически-модифицированные штаммы микроорганизмов, которые обладают набором необходимых признаков [4], либо производят скрининг бактерий на наличие требуемых физиолого-биохимических качеств [5; 6]. Одним из важнейших механизмов положительного влияния на развитие растений является синтез фитогормонов [7–9], в том числе индолилуксусной кислоты и её производных. Кроме положительного эффекта на жизнедеятельность растений экзогенная индолил-3-уксусная кислота способна также оказывать воздействие на ферментативную активность почв и на прирост бактериальной биомассы [10].

Поэтому особо актуальным является вопрос о подборе микроорганизмов и растений для проведения биологической очистки почвы от токсичных химических соединений. Наиболее часто в технологии ризоремедиации используются представители рода Pseudomonas, но потенциально перспективными являются представители р. Rhodococcus. Так, инокуляция почвы штаммом Rhodococcus erythropolis P30 способствовала экстракции тяжелых металлов растениями из среды [11]. Успешная реализация ризоремедиации зависит и от выживания и роста растений на загрязненных участках, а также от способности их корней поддерживать активность микробного населения почвы [12]. Для повышения скорости ризоремедиации используются толерантные виды растений с быстрым ростом и мощной корневой системой [13].

Целью настоящей работы было изучение влияние температуры и источников углерода на биосинтез индолил-3-уксусной кислоты штаммом Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D, выявление фитостимулирующей активности данного микроорганизма в условиях почвенного эксперимента. Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D был выделен сотрудниками кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета и ранее был успешно использован в технологии биоремедиации загрязненного нефтью грунта [14–16].

Для культивирования микроорганизмов использовали стандартную минеральную среду следующего состава (г/л): KNO₃ – 4; Na₂HPO₄ – 1,4; KH₂PO₄ – 0,4; MgSO₄×H₂O – 0,8 [17]. С целью оценки влияния температуры среды на выход фитогормона Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D культивировался при разных (15, 25, 35°С) температурах. В качестве источников углерода в среде использовали сахарозу и гексадекан, в концентрациях 10 г/л. В качестве вещества-предшественника в биосинтезе ауксина использовали триптофан, в концентрации 0,5 г/л.

Для обнаружения в культуральной жидкости ауксина и определения его концентрации проводили реакцию Сальковского на индолилуксусную кислоту и её производные. Согласно методике [18], к супернатанту добавляли реактив (0,05М FeCl₃ в 37% растворе хлорной кислоты HClO₄), после прохождения цветной реакции концентрацию ИУК определяли фотометрически по калибровочному графику, изображенному на рис. 1.

 

Рисунок 1 – Калибровочная кривая для определения концентрации ИУК в среде

 

Фитостимулирующий эффект был показан в почвенном эксперименте с применением газонной травосмеси (Festuca rubra – 30%, Lolium perenne – 30%, Poa pratensis – 20%, Festuca rubra trichlorophylla – 15%, Festuca ovina – 5%). Для учета общего микробного числа (ОМЧ) использовали метод высева из серийных разведений на питательный агар.

Физиологические особенности бактерий вида Rhodococcus erythropolis позволяет представителям данного вида развиваться в относительно широком диапазоне температур, сохраняя при этом свои метаболические возможности. Обнаружены различия в продукции ауксина при разных температурах на разных типах углеродных субстратах. Если источником углерода выступал сахароза, то максимальная продукция фитогормона 34,4 мкг/мл наблюдалась при температуре 15°С (табл. 1). Тогда как при 25 и 35°С значения статистически не отличались и составляли 19,8 и 16,1 мкг/мл соответственно. Данные различия в количестве синтезируемого фитогормона могут быть связаны с особенностями жизнедеятельности родококков, открывая возможность применения данного штамма как фитостимулятора в психрофильных условиях. Это не противоречит имеющимся в литературе сведениям о том, что при низких температурах наблюдается увеличение физиолого-биохимической активности данных микроорганизмов [19].

 

Таблица 1 – Влияние температуры и источников углерода на биосинтез ИУК Rhodococcus erythropolis B2

Источник углерода	Концентрация ИУК при различных температурах, мкг/мл
	15°С	25°С	35°С
Сахароза	34,42±0,95*	19,8±1,33	16,1±1,25
Гексадекан	49,47±4,00	77,69±6,81*	46,42±4,45

 

При культивировании микроорганизмов на гексадекане максимальный выход фитогормона отмечен при температуре 25°С, и он составил 77,69 мкг/мл. Можно предположить, что данная картина обусловлена отчасти слабой проницаемостью гексадекана как гидрофобного углеводорода в клетки при его температуре плавления менее 18°С и его деструктивными эффектами как неполярного растворителя для мембран бактерий при повышении температуры до 35°С. В литературных источниках имеются сведения о том, что ризосферные псевдомонады способны синтезировать максимальные количества ИУК в концентрации 70 мкг/мл при температуре в диапазоне 26–28°С [20], сравнительных данных по родоккам не известно. К ИУК в культуральную жидкость может приводить изменение в химическом строении клеточных мембран. К переменам в составе миколовых кислот в мембранах клеток бактерий приводят используемые источники углерода, что отражается на проницаемости мембраны клеток бактерий [21]. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что родококки, обладая набором физиолого-биохимических характеристик, способны лучше адаптироваться к изменению условий окружающей среды, что дает им преимущество в условиях стресса. В целом показано, что исследуемый штамм способен к продукции фитогормона в присутствии не только углеводородных поллютантов, но и на углеводах, которые могут поступать в почву с корневыми экссудатами растений.

Оценку фитостимулирующих свойств штамма бактерии Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D проводили в полевом эксперименте – в почвенных условиях урбанозёма с высевом газонной травосмеси. На территории Кубанского государственного университета были заложены 5 площадок размером по 0,1 м², на участке урбанозёма с отсутствующей естественной растительностью. Каждая из них засевалась газонной травой и обрабатывалась индивидуально биологическим или химическим агентом каждые 5 дней в течение 20 суток. Участок № 1 – культуральная жидкость, отобранная как супернатант после центрифугирования исходной жидкой культуры; № 2 – биомасса клеток, осажденная ценрифугированием; № 3 – нативная жидкая культура (ЖК) исследуемого штамма; № 4 – раствор химически синтезированной ИУК, равный по концентрации содержанию ИУК в бесклеточной жидкости (50 мг/л); № 5 – контроль (соответствующий объем воды) (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Фотография полевых участков и варианты обработки биологическими и химическими агентами

 

Фитостимулирующие свойства оценивали по 3 показателям – сырой фитомассе, динамике всхожести газонной травы и концентрации микроорганизмов в почве.

К 20 суткам эксперимента был произведен замер сырой массы побегов, которая количественно отражает развитие растений. Данный показатель часто используют при характеристике штаммов микроорганизмов, которые в перспективе могут быть использованы как основа биопрепарата [22].

Ввиду того, что субстрат, освещённость и влажность на всех площадках были одинаковыми, различия массы всходов на момент окончания эксперимента – показатель влияния вносимых агентов. Газонная трава, обработанная культуральной жидкостью с клетками и без клеток, демонстрировала выход фитомассы более 100 г/м². В свою очередь участок с газоном, в который вносились суспендированные клетки, имел массу до 20 г/м² (рис. 3). Это говорит о решающем значении внеклеточных метаболитов исследуемого микроорганизма при оценке его фитостимулирующих свойств. Однако роль ИУК неоднозначна, так как участок, который обрабатывался химически полученным фитогормоном, схожих результатов не показал. Вероятно, метаболиты бактерии Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D содержат дополнительные факторы, оказывающие прямое или опосредованное влияние на растения.

 

Рисунок 3 – Сырая фитомасса на момент окончания эксперимента

 

К 20 суткам было отмечено влияние исследуемого микроорганизма на всхожесть. На контрольном участке всхожесть принята за 100%. Раствор химически синтезированной ИУК показал результат ниже контрольного. Площадки, обработанные клетками или метаболитами Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D (рис. 4), значительно превосходили контроли.

 

Рисунок 4 – Динамика всхожести газонной травы в течение эксперимента

 

Для оценки микробиологической активности урбанозёма, а также оценки её динамики в ходе эксперимента был произведён учёт данных по общему микробному числу (ОМЧ) гетеротрофных аэробных микроорганизмов в 1 г почвы. Результаты этих исследований отражены в таблице 2.

 

Таблица 2 – Динамика ОМЧ (КОЕ/г почвы) на полевых участках

Сутки	КЖ	Клеточная суспензия	Нативная культура	Раствор ИУК	Вода
5	4,9×10⁵	3,4×10⁵	6,1×10⁵	2,6×10⁵	2,7×10⁵
15	1,4×10⁶	2,6×10⁶	9,6×10⁶	8×10⁵	1,5×10⁶
25	2,1×10⁸	1,2×10⁸	10⁸	2,8×10⁷	5,9×10⁶

 

Как видно, через 5 суток после обработки отсутствовал заметный эффект по влиянию на концентрацию микроорганизмов в почве – на всех участках она составляла 10⁵ КОЕ/г, колеблясь внутри порядка от (2,6 до 6,1)×10⁵. К 15-м суткам ОМЧ увеличилось во всех образцах, кроме обработанного раствором ИУК до 10⁶ КОЕ/г. К 25-м суткам опыта на всех участках, обработанных биологическими агентами на основе нефтеокисляющего родококка, концентрация клеток составила (1–2,1)×10⁸ КОЕ/г, что на 2 порядка превышало контроль с обработанной водой и на 1 порядок – обработанный химически синтезированной ИУК. Можно отметить, что биологическая обработка родококком оказала стимулирующий эффект не только на ростовые характеристики растений, но и на общую микробиологическую активность почвы.

Выводы. В результате проведённого эксперимента показано, что штамм-деструктор нефтепродуктов Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D способен к продукции фитогормона ауксина как на углеводородном, так и на углеводном источнике углерода. Это открывает возможность комплексного использования данного микроорганизма в качестве продуцента фитогормона как на основе нефтепродуктов-поллютантов почв, так и на углеводных выделениях корневых экссудатов растений-фиторемедиантов. Температурная зависимость продукции имела разный характер – на сахарозе максимальный выход в 34,3 мкг/мл при 15°С и на гексадекане 82,95 мкг/мл при 25°С.

В полевом эксперименте показано, что максимальной фитостимулирующей активностью по отношению к газонной траве в условиях урбанозёма обладали супернатант и нативная жидкая культура штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017D. Они в несколько раз увеличивали сырую фитомассу и всхожесть газонной травы относительно обработки водой и химически синтезированной ИУК. Аналогично была повышена на 1–2 порядка и численность аэробной гетеротрофной микрофлоры в почве при обработке цельной жидкой культурой родококка, а также культуральной жидкостью и биомассой клеток на её основе. Также обработка родококком оказала положительный эффект на общую микробиологическую активность почвы, которая является важным показателем восстановления нарушенной экосистемы.

About the authors

Dmitrii Nikolaevich Otroshko

Kuban State University

Author for correspondence.
Email: otroshko_dmitrii@mail.ru

postgraduate student of the Chair of Genetics, Microbiology and Biotechnology

Russian Federation, Krasnodar

Vladislav Viktorovich Sheremet

Kuban State University

Email: sheremet-vlad-bio@yandex.ru

master student of Faculty of Biology

Russian Federation, Krasnodar

Nikita Nikolaevich Volchenko

Kuban State University

Email: volchenko.n@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of the Chair of Genetics, Microbiology and Biotechnology

Russian Federation, Krasnodar

Aleksandr Aleksandrovich Khudokormov

Kuban State University

Email: sashokas@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of the Chair of Genetics, Microbiology and Biotechnology

Russian Federation, Krasnodar

Andrey Aleksandrovich Samkov

Kuban State University

Email: andreysamkov@mail.ru

candidate of biological sciences, lecturer of the Chair of Genetics, Microbiology and Biotechnology

Russian Federation, Krasnodar

References

Supplementary files