A STUDY OF LIFE CYCLE FEATURES OF THREE STRAINS OF CYANOBACTERIA NOSTOC CF. PUNCTIFORME VAUCH

Full Text

Цианобактерии являются наиболее сложно морфологически и генетически устроенными организмами среди прокариотов. Это обусловливает их широкое распространение и высокий адаптационный потенциал по отношению к негативным биотическим и абиотическим факторам окружающей среды. Кроме того, неприхотливость к условиям искусственного культивирования и высокие темпы роста, особенности физиолого-биохимических процессов (способность к оксигенному фотосинтезу, фиксации молекулярного азота и др.) (Громов 1976), частое обнаружение цианобактерий в симбиотических взаимоотношениях определяют необходимость выявления и поддержания их биоразнообразия, а также успешность выбора в качестве биотехнологического объекта. Однако для решения теоретических и прикладных задач биологии, биотехнологии и экологии необходимо более полное понимание биологических особенностей цианобактерий, в частности, морфологического разнообразия популяций, данных по которым в настоящее время всё еще недостаточно. Известно, что нитчатые и колониальные цианобактерии в естественных и лабораторных популяциях чаще всего находятся в разных возрастных состояниях (status), которые морфологически зачастую очень сильно отличаются друг от друга, но являются сходными со зрелыми особями представителей других родов цианобактерий. Так, в работе Н.В. Кондратьевой (1975) у индивидов рода Nostoc Vauch. наблюдаются status оscillatorioideus, st. cylindrospermoideus, st. anabaenoideus, st. angulato-flexuosus, st. punctiforme, st. sphaericus, st. stratosus. Возрастное состояние st. оscillatorioideus характеризуется расползанием прямых или слегка изогнутых гормогониев, удлиняющихся и собирающихся в пучки, где они располагаются относительно параллельно; st. cylindrospermoideus - прорастанием и увеличением в ширину гормогониев, прямыми осциллаториеподобными нитями с терминальными гетероцистами; st. anabaenoideus - подобно st. cylindrospermoideus, но с интеркалярными гетероцистами; st. angulato-flexuosus - возникновением зигзаговидных нитей с расширенными клетками, появлением косых перегородок и зачатков колониальной слизи; st. punctiforme - точковидными микроскопическими колониями, образующимися из зигзаговидных нитей, окруженных колониальной слизью; st. sphaericus - шаровидными и полушаровидными колониями до 5 мм в диаметре; st. stratosus - повторным разделением и слиянием нитей и колоний, относящихся к предыдущим этапам развития (Кондратьева, Кислова 1992). Морфологические преобразования, происходящие в течение жизненного цикла, ведут к проявлению полного комплекса признаков, свойственных определенным видам (Schüßler et al. 1997). Понимание закономерностей чередования стадий развития позволит точнее идентифицировать таксономическую принадлежность цианобактерий, так как зачастую разные стадии морфологически очень сильно отличаются друг от друга (Вассер и др. 1989), а также наиболее эффективно использовать их в сфере биотехнологической промышленности (Кокшарова 2008) или биоиндикации (Шкундина и др. 2010). Последнее обусловлено тем, что на внутривидовое разнообразие цианобактерий могут оказывать влияние те или иные экологические факторы, в результате чего могут произойти изменения жизненного цикла (Becerra-Absalоn, Tavera 2009). Nostoc - род нитчатых азотфиксирующих цианобактерий, обладающих сложным жизненным циклом с дифференцированием клеток на гетероцисты, акинеты и гормогонии, способных к образованию ассоциаций, сообществ и биопленок с участием различных микроорганизмов. Представителей рода можно найти в почве, на влажных скалах, на дне водоемов (как пресных, так и соленых), редко в морских местообитаниях (Голлербах и др. 1953; Komarek 2013), а также в экстремальных, в частности, в пещерах (Abdullin, Sharipova 2004; Абдуллин 2005; Абдуллин, Миркин 2015). Целью данной работы является изучение жизненного цикла трех штаммов цианобактерии Nostoc sp., выявление особенностей и длительности их стадий развития, морфологических преобразований, образования гетероцист. Материалы и методы Материалом для исследований послужили штаммы цианобактерий Пк20ж (выделен из грунта пещеры Геологов-2, Пермский край), Св31ж (выделен из грунта пещеры Северная, Свердловская область) и Чх55 (выделен из грунта пещеры под висячим камнем, г. Уфа). Для выделения альгологически чистых культур применяли стандартные микробиологические методы (Шарипова, Дубовик, 2012). Штаммы культивировались в жидкой минеральной среде Громова № 6 при комнатной температуре и освещенности 760 лк с периодичным пересевом раз в два месяца. Для изучения жизненного цикла использовали два метода. Метод «висячей капли» (Сиренко и др. 1975): в каплю помещали несколько гормогониев цианобактерии (гормогонии - многоклеточные фрагменты трихомов цианобактерий, служащие для размножения и способные к передвижению). Второй метод: инокуляция 30-дневных культур цианобактерий (0,5 г сырой биомассы на 30 мл среды) в жидкую питательную среду Громова № 6 в чашки Петри. Дальнейшее культивирование проходило при комнатной температуре и естественном освещении. Ежедневные наблюдения в течение месяца проводили при помощи микроскопа Levenhuk, данные обрабатывали с использованием программы Levenhuk Toup View. Наблюдения проводили в не менее чем 3 биологических повторностях в чашках Петри и препарате «висячая капля», где было просмотрено не менее 100 трихомов. Систематическую принадлежность цианобактерий устанавливали с помощью молекулярно-генетического анализа. Штаммы цианобактерий собирали во время экспоненциальной фазы роста и концентрировали центрифугированием. Общая геномная ДНК была выделена согласно Echt et al. (1992) с некоторыми модификациями (Kiselev et al. 2015). Для амплификации гена 16S рРНК и соответствующей области внутреннего транскрибированного спейсера (ITS) 16S-23S использовали следующие праймеры: праймер 1 ITS-340R (5'-CTC TGT GTG CCT AGG TAT CC-3) ') согласно Wilmotte et al. (1993) и праймер 2 CYA359F (5’-GGG GAA TTT TCC GCA ATG GGG-3 ’) согласно Nübel et al. (1997), как ранее подробно описано Boyer et al. (2001). ПЦР-амплификацию проводили с помощью T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Продукты ПЦР очищали реагентом для очистки продуктов ПЦР ExoSAP-IT (Affymetrix Inc., США) и секвенировали в обоих направлениях в Инструментальном центре биотехнологии и генной инженерии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН с использованием генетического анализатора ABI 3500 (Applied Biosystems, США) с набором для секвенирования BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, Maryland, USA) и теми же праймерами, которые использовались для ПЦР. Последовательности были собраны с помощью пакета Staden v.1.4 (Bonfield et al. 1995) и выровнены вручную в программе SeaView (Galtier et al. 1996). Результаты и обсуждение Результаты поиска BLAST показали, что штамм Пк20ж генетически наиболее близок в GenBank к штамму Nostoc sp. CALU 907 (KX424439.1), штамм Св31ж - к штамму Nostoc sp. CMT-1BRIN-NPC12 clone E2 (MH427677.1), штамм Чх55 - к штамму Uncultured Nostoc sp. clone UK104 (JQ007802.1). Таким образом, все три штамма являются видами рода Nostoc. С помощью определителей (Голлербах и др. 1951; Komarek 2013) на основании морфологических особенностей штаммы были определены как Nostoc cf. punctiforme. Отправной точкой изучения жизненного цикла штаммов Nostoc cf. punctiforme. стало выделение, перенос в висячую каплю и в чашки Петри и дальнейшее наблюдение гормогониев, массовое образование которых вызывается обычно значительным изменением условий среды (например, увеличение в окружающей среде количества питательных веществ). Поэтому для их получения небольшое количество биомассы цианобактерий инокулировали в свежую минеральную среду Громова № 6, после чего уже на 2-3 день у всех трех штаммов наблюдали образование гормогониев (st. oscillatorioideus). Так как трихомы цианобактерий в процессе роста переплетаются между собой беспорядочным образом, было решено отдельно в «висячей капле» проследить развитие трех гормогониев штамма Пк20ж (рис. 1). В последующие дни (2-5-е сутки) происходило прорастание гормогониев, при котором трихомы утратили способность к движению, начали активно делиться в длину, клетки трихомов расширялись (не всегда равномерно по всей длине нити). Уже на 5-е сутки было отмечено появление первых косых перегородок и зигзаговидное искривление нити (переход к st. angulato-flexuosus). На 6-е сутки стадия проявилась более отчетливо (рис. 2), при этом образования гетероцист не наблюдалось. Рис. 1. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж- st. oscillatorioideus, 2-е сутки Рис. 2. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. angulato-flexuosus, 6-е сутки Далее также происходило удлинение трихомов с последующим расширением вегетативных клеток, искривлением нитей и поперечным делением клеток. На 8-е сутки на участках нитей, где происходило наибольшее сгущение клеток, можно было заметить начало образования первичного влагалища вокруг трихома (рис. 3). Это свидетельствует о начале перехода к следующей стадии развития - st. punctiforme. К этой стадии относят точковидные микроскопические колонии, образующиеся из зигзаговидных нитей, вокруг которых возникли влагалища, затем превращающиеся в колониальную слизь (Кондратьева, Кислова 1992). Через две недели с начала эксперимента стадия st. punctiforme стала ярко выраженной (рис. 4). Однако, несмотря на то, что на 15-е сутки микроколонии приобрели более четкие границы, их рост и формирование на этом не закончились, и к 19-му дню две из трех колоний приобрели почти шаровидную форму, тогда как третья проявила тенденцию к образованию кружевовидной колонии, стала более рыхлой и начала распадаться на отдельные трихомы (рис. 5). Рис. 3. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - переход со st.angulato-flexuosus к st.punctiforme, 8-е сутки Рис. 4. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. punctiforme, 15-е сутки Рис. 5. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. punctiforme, 19-е сутки Как известно, размножение у цианобактерий со сложным жизненным циклом может происходить не только у особей, находящихся на конечных стадиях развития, но и на промежуточных и даже начальных стадиях (Вассер и др. 1989). Так и в нашем случае, с 19-го дня на стадии st. punctiforme начался процесс образования вторичных гормогониев, проходящий явно интенсивнее в третьей колонии (рис. 6). Через три недели (22-е сутки наблюдений) все три микроскопические колонии приобрели кружевовидную форму, причем у двух из них наблюдался четко оформившийся сферический центр, из которого в разные стороны выходили многочисленные переплетенные трихомы разной длины (рис. 7). Через месяц наблюдения можно было заметить, что как вышедшие из колоний вторичные гормогонии, так и направленные в разные стороны трихомы колоний развиваются морфологически в той же последовательности, и в тех же временных рамках, что и первоначально отобранные особи (рис. 8). К этому моменту диаметр микроколоний достиг 150 мкм в диаметре, еще не произошло перехода из st. punctiforme в st. sphaericus, которая характеризуется различимыми глазом шаровидными и полушаровидными колониями до 3,5 мм в диаметре. Рис. 6. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. punctiforme, образование вторичных гормогониев, 19-е сутки Рис. 7. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. punctiforme, 22-е сутки Рис. 8. Nostoc cf. punctiforme. Пк20ж - st. punctiforme, 31-е сутки Можно предположить, что выявленные нами периоды смены возрастных стадий характерны в целом для многих представителей рода Nostoc и часто зависят от экологических факторов. Так, например, известно, что появление st. punctiforme (Кондратьева 1989) в жизненном цикле Nostoc linckia Born. ex Born. et Flah. было отмечено на 5-8-е сутки при высоком уровне освещенности и на 23-25-е сутки при низком (в нашем случае на 15-е при естественном комнатном освещении). Также было исследовано развитие цианобактерий в чашках Петри со свежей жидкой питательной средой Громова № 6, для чего были использованы культуры штаммов цианобактерий Пк20ж, Св31ж и Чх55 в возрасте 1 месяца, в количестве 0,5 г биомассы на чашку. При этом филаменты цианобактерий находились в разных возрастных состояниях (st. оscillatorioideus, st. cylindrospermoideus, st. anabaenoideus, st. angulato-flexuosus, st. punctiforme). Было выявлено, что процесс смены стадий развития штаммов в чашках Петри отставал по времени в сравнении с таковым в препарате «висячая капля» на 2-3 дня, при этом морфологически и морфометрически прохождение разных стадий совпадало. Так, стадия st. angulato-flexuosus была отмечена на 8-е сутки (рис. 9), а st. punctiforme - на 17-е (рис. 10). При st. punctiforme отмечено образование беспорядочного переплетения зигзаговидных трихомов, из которого через месяц наблюдений формировались центры микроколоний. При проведении опыта в чашках Петри появление вторичных гормогониев наблюдали уже со 2-3-го дня наблюдения. Возможно, помимо изначальной возрастной разнородности, это связано с наличием достаточного количества питательных веществ и стремлением популяции наиболее полно занять жизненное пространство. Рис. 9. Nostoc cf. punctiforme. - st. angulato-flexuosus, 8-е сутки Слева - штамм Св31ж, справа - штамм Чх55 Рис. 10. Nostoc cf. punctiforme- st. punctiforme, 17-е сутки Слева - штамм Св31ж, справа - штамм Чх55 Также у штамма Чх55 на 4-е сутки эксперимента было выявлено наличие стадий st. cylindrospermoideus и st. anabaenoideus (доминирования индивидов, находившихся в этих двух состояниях, не было). Первая характеризуется прямыми осциллаториеподобными нитями с терминальными гетероцистами, а вторая - с интеркалярными (рис. 11). При этом первая гетероциста у штамма Пк20ж в препарате «висячая капля» появилась лишь на 15-е сутки, а у штамма Св31ж подобной дифференциации клеток вовсе не наблюдалось. Известно, что образование гетероцист зачастую связано с ограниченным наличием связанного азота в среде (Meeks et al. 2002). Однако все три штамма находились в одинаковых условиях (температура, освещенность, состав питательной среды), в связи с чем можно предположить, что подобное различие объясняется внутривидовой изменчивостью, отмеченной у цианобактерий на популяционном, клеточном и субклеточном уровнях (Баулина 2005). Так как все штаммы выделены из разных местообитаний, то различия в их клеточной дифференцировке могут служить адаптацией к местным факторам окружающей среды (Паламарь-Мордвинцева, Царенко 2010). Рис. 11. Nostoc cf. punctiforme. Чх55 - st. cylindrospermoideus (слева) и st. anabaenoideus (справа) Таким образом, в процессе исследования жизненного цикла штаммов цианобактерии Nostoccf. punctiforme было выявлено: 1. Все штаммы проходят несколько этапов развития: образование гормогониев (st. оscillatorioideus, 1-е сутки), их прорастание - удлинение, увеличение ширины клеток и появление гетероцист (st. оscillatorioideus, st. cylindrospermoideus и st. anabaenoideus; 2-5-е сутки), переходный этап от нитчатых стадий к колониальным - косое или продольное деление клеток, появление зачатков колониальной слизи (st. angulato-flexuosus, 5-7-е сутки), колониальную стадию - характерный этап для цианобактерий рода Nostoc, образование микро- и макроколоний (st. punctiforme, с 14-х суток и более месяца; st. sphaericus, st. stratosus). 2. Время прохождения стадий развития в гетерогенной популяции сдвигается в сторону увеличения на 2-3 дня по сравнению с развитием изолированных гормогониев. В связи с этим изучение реакции вида на изменение условий окружающей среды и подбор оптимальных условий культивирования позволит в дальнейшем максимально полно использовать его в биотехнологических целях, в частности, при создании биопрепаратов для применения в сельском хозяйстве, при биотестировании и биоиндикации. 3. Различный характер образования гетероцист у трех исследованных штаммов служит, вероятно, проявлением внутривидовой изменчивости цианобактерии Nostoccf. punctiforme. Полученные нами данные помогут в отборе перспективных штаммов для биотехнологии и в дальнейшем могут использоваться при проведении различных физиолого-биохимических исследований (например, при определении образуемых цианобактериями вторичных метаболитов), результаты которых могут, вероятно, отличаться на разных этапах развития данных микроорганизмов.

About the authors

E. Yu Egupova

Bashkir State University

Department of Biochemistry and Biotechnology

M. Yu Sharipova

Bashkir State University

Doctor of Biological Sciences, Professor atthe Department of Physiology and General Biology

Sh. R Abdullin

Federal Scientific Center of the East Asian Terrestrial Biodiversity, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher of the Laboratory of Botany

References

Supplementary files