Функционирование дыхательной цепи митохондрий фибробластов линии Bj в условиях глюкозного голодания и воздействия различных доз ротенона

Полный текст

Введение Известно, что старение характеризуется структурными и нейрофизиологическими изменениями в головном мозге, что приводит к когнитивным нарушениям различной степени, и зачастую сопровождается нейродегенеративными заболеваниями. С увеличением продолжительности жизни нейро-дегенеративные расстройства становятся все более распространенными и представляют одну из основных проблем здравоохранения. При этом этиология заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, изучена недостаточно и является очень сложной и многофакторной [1, 2]. Некоторые случаи указанных заболеваний связывают с генетической предрасположенностью, тогда как большая часть, как показано, зависит от экзогенных факторов [3] Современные исследования патогенеза болезни Паркинсона демонстрируют, что изменения в регуляции функций митохондрий в нервных клетках могут влиять на развитие болезни [4]. Нарушения функции и структуры митохондрий ведет к увеличению проницаемости их мембраны для катионов, разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования, что является одним из основных факторов в процессе старения и демиелинизации [5, 6]. Известно, что митохондриальная недостаточность и дисрегуляция металлопротеиназ семейства AAA и транслоказ наружной мембраны митохондрий семейства TOM, ответственных за созревание белковых комплексов дыхательной цепи, могут быть связаны со многими нейродегенеративными заболеваниями, в том числе и болезнью Паркинсона [7]. На клеточной модели данного заболевания in vitro показано, что процедуры, направленные на восстановление гомеостаза митохондрий, являются весьма эффективными для возможной реверсии заболевания и восстановления работы дофаминэргических нейронов [8, 9] Таким образом, накопление продуктов окисления и нарушение митохондриогенеза приводит к тому, что основная функция митохондрий в нейронах - поддержание трансмембранного градиента и энергетического обмена при синапсической передаче, а также Ca2+ гомеостаза нарушается [10-12]. Также митохондрии являются главными производителями токсичных свободных радикалов в клетке, поэтому мутации в их ДНК происходят чаще, чем в ядерной ДНК клеток [13, 14]. Показано, что нарушение функций митохондрий приводит к развитию нейродегенеративных изменений, сопровождающихся нарушением энергетического обмена и синаптической передачи в нейронах [15]. Дефицит дофаминэргических нейронов могут восполнить клетки собственного организма, а именно основные клетки соединительной ткани - фибробласты. Недавно был предложен метод репрограммирования фибробластов до стадии плюрипотентных стволовых клеток, а затем нового «программирования» Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 41 (дифференцировки) этих клеток в нейроны Ученые Гарвардского университета подобным образом получили нейроны из фибробластов, выделенных от обезьян, больных болезнью Паркинсона. Показано, что полученные нейроны экспрессировали дофамин и были успешно трансплантированы в мозг больных обезьян При этом была зарегистрирована кратковременная регрессия заболевания [16]. Однако пути эффективного репрограмирования фибробластов с последующим восстановлением митохондриогене-за в нейронах к настоящему времени не найдены Таким образом, для более глубокого понимания процессов клеточного и митохондриального метаболизма нами были созданы и оптимизированы клеточные модели с митохондриальной дисфункцией на базе иммортализованной клеточной культуры фибробластов человека Bj (BJ ATCC® CRL-2522™). В ходе нашего исследования клетки линии Bj культивировали в среде с содержанием галактозы вместо глюкозы и ингибировали комплекс I дыхательной цепи митохондрий ротеноном [17]. Нами были подобраны условия, приближенные к патологическим при болезни Паркинсона и оптимизированы условия для поддержания клеток в стрессовом состоянии [18]. Благодаря этому, мы смогли проследить некоторые аспекты поведения митохондрий, в частности экспрессию белковых комплексов дыхательной цепи и ферментативную активность дегидрогеназ внутри клетки в условиях стресса Также была подобрана оптимальная концентрация ротенона, поддерживающего клетки в состоянии окислительного стресса, при этом сохраняя их жизнеспособность Материал и методы Варианты культивирования Bj Для оценки экспрессии белковых субъединиц электрон-транспортной цепи фибробластов клетки линии Bj пассажа 13 и 15 (BJ ATCC® CRL-2522™) выращивали в чашках Петри на среде DMEM (Sigma, США) (1 мМ пируват натрия, 21 мМ бикарбонат натрия, 25 мМ глюкозы или 10 мМ галактозы, 4 мМ глутамина, 10% FBS; РЕі 7,2-7,3), до 70-80% плотности монослоя Концентрация сахаров 25 мМ или 10 мМ галактозы принята за 100%. Пересев клеток проводили в соотношении 1:4. Затем при достижении 50% плотности монослоя клетки были помещены в среду с 50% галактозы - 50% глюкозы, 75% галактозы - 25% глюкозы и 100% галактозы соответственно Через 72 ч культивирования клетки были помещены в среду DMEM со 100% галактозы Контрольные клетки в среде со 100% глюкозы были помещены в новую среду со 100% глюкозы, в то же время, что и экспериментальная группа клеток После 24 ч клетки при 90% плотности монослоя пересевали, и часть клеток была осаждена и заморожена на -80°С для дальнейшего анализа Клетки, выращенные в среде со 100% содержанием глюкозы до 80% плотности монослоя (слияние, конфлюэнтность) пересевали 1:3 и заменяли среду на DMEM c содержанием 50% галактозы, 50% глюкозы, 75% галактозы, 25% глюкозы, и 100% галактозы, контролем послужили клетки в среде со 100% содержанием глюкозы Клетки, культивируемые в среде со 100% содержанием галактозы, не выжили. Клетки c 50% удержанием галактозы и 50% глюкозы были выращены до 80% плотности монослоя и заморожены для иммуноблоттинга, контрольные клетки также были заморожены на этом этапе Клетки, выращенные в среде со 100% содержанием глюкозы до 90% плотности монослоя были пассированы 1:6 и культивировались в среде с 50% галактозы, 50% глюкозы, 75% галактозы, 25% глюкозы и 100% глюкозы как контрольные клетки. Затем после 24 ч. инкубации клетки были помещены в среду с различным содержанием глюкозы и галактозы; после достижения 80% плотности монослоя клетки пересевали 1:2 Часть клеток использовали для последующего анализа экспрессии белковых комплексов дыхательной цепи методом иммуноблоттинга. Иммуноблоттинг (вестерн-блот) Осадок клеток был разморожен на льду и растворен в 20-50 мкл 1Х лизирующего буфера (Thermo scientific MSDS lysis buffer 10 x, США) с последующим криолизом. Концентрацию белка в лизатах клеток определяли с использованием набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit. Далее клеточные лизаты Bj экспериментальных и контрольных групп были алик-вотированы с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Sigma, США). Использовали первичные антитела к белку TOM20 (Santa Cruz Biotechnology, США) и к белковым субъединицам электрон-транспортной цепи - OXPHOS (Abcam, Великобритания) 1:500. Вторичные антитела: Goat anti rabbit SC2007 and Goat anti mice SC2009 (Santa Cruz Biotechnology, США) использовались в рекомендованной для иммуноблоттинга концентрации Электрофорез и перенос белков на PVDF мембрану был произведен с использованием стандартного протокола для электрофореза белков в денатурирующих условиях Для визуализации результатов использовался раствор Ponceau S (Sigma, США) и набор реагентов для хемилюминесцентной детекции Vistra ECFTM (Sigma, США). Для количественной оценки результатов была использована система визуализации (Biospectrum 500, США) и программное обеспечение ImageJ Валидацию результатов проводили с помощью программного обеспечения ImageJ по отношению яркости пикселей окрашивания Ponceau S и ECFTM Измерения активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий в условиях добавления различных концентраций ротенона Клетки линии Bj 15 и 16 пассажа культивировали в чашках Петри до 90% плотности монослоя, после обработки различными концентрациями ротенона, разведенного в 70% этаноле. Далее клетки в концентрации 7х106, эквивалентные примерно 2 мг белка, трипсинизировали и промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (ПанЭко, Россия) с дальнейшим центрифугированием 500 g в течение 10 мин при 4°С, и ресуспендированы в ФСБ при 4°С. Клетки содержались при -80°С до использования Осадок клеток растворяли в 50 мкл лизирующего буфера с последующим криолизом и определением концентрации белка. Для измерения активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий использовали буфер (25 мМ K2HPO4, рН 7,4, 5 мМ MgCl2, 0,25% бычий сывороточный альбумин, 3,7 мкМ антимицина и 2 мМ KCN) в объеме, согласно количеству образцов (120 мкл анализируемой смеси на Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 42 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 лунку 96-луночного планшета) а также количество, необходимое для разбавления образцов. Образцы клеток после оттаивания и лизиса были разведены в буфере для измерения до 75 и 37,5 мкг белка на лунку. В тестовые и контрольные лунки 96-луночного планшета был добавлен буфер для измерения активности комплекса I. Далее в опытные лунки было добавлено по 5 мкл 70% этанола и по 5 мкл 5,7 мМ НАД-Н, в контрольные лунки было добавлено по 5 мкл 0,36 мМ ротенона в 70% этаноле и по 5 мкл 5,7 мМ НАД-Н. Затем в контрольные и экспериментальные лунки было добавлено по 10 мкл клеточных лизатов до заданных конечных концентраций. Смесь инкубировали в течение 5 мин при 37°С Реакцию инициировали добавляя 2,8 мМ CoQ1 (коэнзим Q) во все лунки. Измерение уменьшения оптической плотности в течение 15 мин. определяли при длине волны 340 нм с референсным значением 380 нм Скорость реакции (А поглощение / мин. ) с учетом молярного коэффициента экстинкции НАД-Н (4,8 мм-1 см-1; при 340 нм) была рассчитана согласно методу Шервуда и Херста [18]. Активность комплекса I дыхательной цепи была рассчитана путем вычитания скоростей реакций в присутствии и в отсутствие ротенона, по формуле: ЕА/мг клеточного белка = ((А поглощение / мин) ж (коэффициент разбавления) х (1 / є) (1 / 0,18) (1000 мкг / мг)) / (мкг / мкл белка) = активность фермента / мг белка, где А поглощение / мин. - изменение оптического поглощения в мин ; длина пути ячейки спектрофотометра уже была рассчитана в машине во время кинетики; и є - молярный коэффициент поглощения, для окисления НАД-Н при 340 нм є = 6,81 mmol х L-1x cm-1 согласно методу [18]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни. Результаты и обсуждение Оценка экспрессии белковых субъединиц OXPHOS и белка TOM20 в зависимости от условий культивирования. В ходе исследования было использовано два пути адаптации фибробластов к безглюкозной среде DMEM D5030 (среда OXPHOS) с различным процентным содержанием галактозы при сменах среды или пересева клеток. Предполагалось, что данная среда приведет клетки линии Bj к условиям стресса и усилению работы дыхательной цепи митохондрий Согласно первому способу культивирования фи-бробластов, наблюдалось повышение экспрессии (p<0,01) белковых субъединиц V и III - АТФ-синтазы и цитохром bc1 комплекса, 54 и 48 кДа соответственно, по отношению к клеткам, выращенным в среде, содержащей 100% глюкозы (рис 1) А кДа мкг 75 - 63 - 48 - 35 - 25 - 20 - 17 - ГлюЮО ГлюЮО Гал75 Гал75 ГалЮО Гал50 Гал50 12.5 25 25 25 25 25 25 Первый метод адаптации Bj Б к+ 22.5 і IV 8 1 і і ° I z Q. О) о В 2J 1.5 0.5 2.5 V- АТРЬА ■ ГлюЮО ГалЮО Гал75 III UQCRC2 I Гал50 Понсо Рис. 1. Результаты иммуноблоттинга OXPHOS после первого метода культивирования: А - К+-митохондриальный экстракт бычьего сердца из набора OXPHOS MS601 с конечной концентрацией белка на лунку геля 22,5 мкг. Глю100 - лизат клеток Bj, выращенных в среде со 100% глюкозы, концентрация белка на лунку 12,5 мкг. Глю100 - лизат клеток Bj, выращенных в среде со 100% глюкозы, 25 мкг. Гал75 - лизат клеток Bj, 25% глюкоза и 75% галактоза, 25 мкг. Гал100 - лизат клеток Bj, 100% галактоза, 25 мкг. Гал50 - лизат клеток Bj, 50% глюкоза и 50% галактоза, 25 мкг. Понсо - краситель белков по петидным группам; Б - количественное представление результатов иммуноблоттинга экспрессии V комплекса АТФ-синтазы; В - III комплекса цитохрома bc1; I - НАД-Н дегидрогеназа; IV - цитохром c-оксидаза Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 оригинальные исследования 43 Также по отношению к контролю (клетки, выращенные на глюкозной среде DMEM) наблюдалась незначительная экспрессия I и IV белковых комплексов НАД-Н дегидрогеназы и цитохром c окси-дазы, 18 и 30 кДа соответственно Отмечено отсутствие экспрессии комплекса II дыхательной цепи сукцинат дегидрогеназы. Можно предположить, что отсутствие ввода в дыхательную цепь дополнительных электронов за счёт окисления сукцината не является обязательным для фибробластов линии Bj при данных условиях культивирования рис 1) В клетках линии Bj в стрессовых условиях, достигнутых при использовании первого пути культивирования в OXPHOS среде с различным % содержанием галактозы, наблюдалось достоверное повышение (p<0,01) экспрессии транслоказы TOM20, принимающей участие в созревании белковых субъединиц электрон-транспортной цепи, прямо пропорциональное повышению уровня галактозы в среде (рис. 2). Это подтверждает полученные нами данные по повышению экспрессии белковых субъединиц III - и цитохром bc1 комплекса и V - АТФ-синтазы. Согласно второму пути культивирования фибро-бластов, где был использован более жесткий подход к адаптации клеток линии Bj к среде OXPHOS с использованием пересева клеток было обнаружено аналогичное повышение экспрессии белковых субъединиц III - цитохром bc1 комплекса и V - АТФ-синтазы по отношению к клеткам, выращенным в среде, содержащей 100% глюкозы и более выраженное повышение экспрессии I и IV белковых комплексов НАД-Н дегидрогеназы и цитохром c-оксидазы по отношению к контрольным клеткам, выращенным в среде DMEM со 100% содержанием глюкозы (рис. 3). Отмечено, что наибольшее повышение экспрессии I и IV белковых комплексов наблюдалось в случае 75% содержания галактозы, что, вероятно, является наиболее оптимальным для индукции стресса клеток линии Bj (p<0,05) Наблюдалось также достоверное повышение экспрессии транслоказы TOM20 (p<0,05) по отношению к контрольным клеткам, но меньше, чем при первом варианте культивирования, что может быть связано с нарушением метаболизма клеток при пересеве, в связи с более жесткой непостепенной адаптацией клеток к среде OXPHOS (рис. 4). А Первый метод адаптации Bj кДа мкг 75 і 63 ' 48 ' 35 1 25 ■ 20 ' 17 ' 75 63 48. 35« 25« 20« ГлюЮО ГлюІОО Гап75 Гал75 Га л 100 Гал50 Гал50 к+ 12.5 25 25 25 25 25 25 22.5 Б 1.5 1.4 12 а о "с 1 Н о 0 « 0.8 1 Э і § ї 5 (U ТО fc і О А о і, 0 2 2 о 0.5 ТОМ20 ГлюЮО ГалЮО Гал75 Гал50 Пон со Рис. 2. Результаты иммуноблоттинга TOM20 после первого метода культивирования: А - К+ - митохондриальный экстракт из бычьего сердца из набора OXPHOS MS601 с конечной концентрации белка на лунку 22,5 мкг; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 12,5 мкг белка на лунку; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 25 мкг; Гал75 - Bjs лизат, 25% глюкоза и 75% галактоза, 25 мкг; Гал100 - Bjs лизат, 100% галактоза, 25 мкг; Гал50- Bjs лизат, 50% глюкоза и 50% галактоза, 25 мкг; Понсо - краситель белков по петидным группам; Б - Количественное представление результатов иммуноблоттинга экспрессии белков TOM20 после первого варианта культивирования: Глю - глюкоза, Гал - галактоза Гены & клетки Том X, № 4, 2015 44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ На основании полученных результатов можно заключить, что клетки Bj, выращенные в OXPHOS среде, характеризовались значительным увеличением экспрессии белковых субъединиц дыхательной цепи и транслоказы TOM20 по сравнению с клетками, выращенными в среде DMEM, содержащей 100% глюкозы (p<0,05). клетки после первого пути адаптации имеют более выраженную экспрессию по сравнению с клетками, адаптированными вторым путем культивирования с помощью пересева. Bj клетки после второго пути адаптации в среде, содержащей 100% галактозы, оказались нежизнеспособны Фибробласты, в частности иммортализирован-ные, отличаются достаточно медленным механиз мом активации митохондрий и адгезии. Мгновенное повышение свободных радикалов и разобщение окислительного фосфорилирования в галактозной OXPHOS среде может привести к нарушению целостности и функционирования электрон-транспорт-ной цепи митохондрий фибробластов и наступления апоптоза [19, 20]. Мы предполагаем, что адаптация к стрессовым условиям также зависит от плотности монослоя клеток, так как первый путь адаптации клеток при плотности монослоя более 80% и без пересева клеток является наиболее эффективным в индукции стресса при сохранении высокой жизнеспособности клеток А кДа мкг 75- 63- 48- 35- 25- 20- 17- ГлюЮО ГлюЮО ГалЮО Гал75 12.5 25 25 25 Гал75 Гал50 25 25 Второй метод адаптации Bj Б к+ 22.5 В о и X о с о X го ш о ГлюЮО ГалЮО Гал75 2.5 IV І 2 2 а. 0 1 1.5 2- 0.5 n О 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Гал 50 ■ III ГлюЮО ГалЮО Гал75 1,1V Гал50 Понсо ІІІІ ГлюЮО ГалЮО Гал75 Гап50 Г Рис. 3. Результаты иммуноблоттинга OXPHOS после второго метода культивирования: А - К+ - митохондриальный экстракт из бычьего сердца из набора OXPHOS MS601 с конечной концентрации белка на лунку 22,5 мкг; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 12,5 мкг; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 25 мкг; Гал100 - Bjs лизат, 100% галактоза, 25 мкг; Гал75 - Bjs лизат, 25% глюкоза и 75% галактоза, 25 мкг; Гал50- Bjs лизат, 50% глюкоза и 50% галактоза, 25 мкг белка на лунку. Понсо - краситель белков по петидным группам; Б - Количественное представление результатов иммуноблоттинга экспрессии V комплекса АТФ-синтазы; В - III комплекса цитохрома bc1. Г - I - НАД-Н дегидрогеназы и IV - цитохром c-оксидазы Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45 А кДа МКГ Второй метод адаптации Bj ГлюЮО ГлюЮО ГалЮО Гал75 12.5 25 25 25 Гал75 Гал50 25 25 К+ 22.5 73 63 48 » 25 20- Б 1.4 и и О) Ä о. о с и I ° n с É ? g го і 3 і § ї 5 О) S H 2 X Q. s о О В CM ГлюЮО ГалЮО Гал75 Гал 50 Понсо Рис. 4. Результаты иммуноблоттинга TOM20 после второго метода культивирования: A - К+ - митохондриальный экстракт из бычьего сердца из набора OXPHOS MS601 с конечной концентрации белка на лунку 22,5 мкг; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 12,5 мкг; Глю100 - Bjs лизат, клеток, выращенных в среде со 100% глюкозы, 25 мкг; Гал100 - Bjs лизат, 100% галактоза, 25 мкг; Гал75 - Bjs лизат, 25% глюкоза и 75% галактоза, 25 мкг; Гал50 - Bjs лизат, 50% глюкоза и 50% галактоза, 25 мкг; Понсо - краситель белков по петидным группам; Б - Количественное представление результатов иммуноблоттинга экспрессии белков TOM20 после второго метода культивирования: Гал - галактоза, Глю - глюкоза Оценка активности комплекса I фибробластов человека линии Bj в присутствии различных доз ротенона клетки линии фибробластов пассажа 15 и 16 были выращены до плотности монослоя 90% в условиях добавления различных доз ингибитора комплекса I дыхательной цепи ротенона (инкубация 24 ч. ). После проведения подготовки интактных клеток было произведено измерение активности комплекса I дыхательной цепи в течение 15 мин в отсутствии и в присутствии ротенона, согласно протоколу, описанному в материалах и методах Результаты энзиматической кинетики показали значительное снижение активности НАД-Н дегидрогеназы с увеличением дозы ротенона, что подтверждается отсутствием окисленного комплексом I НАД-Н, которое было рассчитано путем вычитания скоростей реакций c учетом А Поглощения (340-380 нм) в присутствии и в отсутствие ротенона (рис. 6). А Б -R0.5 (0.150) R 1(0.15) -*-R 5 (0.15) Фон - Контроль 0.15 0 -0.01 -0.02 -0.03 ■0.04 -0.05 -0.06 -0.07 -0.08 -0.09 Время (мин) Рис. 5. Коэффициенты активности комплекса I дыхательной цепи Bj: А - R0.5(0.15) - клетки, обработанные ротеноном в концентрации 0,5 мкМ с конечной концентрацией 0,15 мкг клеточного белка; R1(0,15) - 1 мкМ и 0,15 мкг клеточного белка; R5(0,15J - 5 мкМ и 0,15 мкг клеточного белка. Фон - фон реакции без клеток; контроль - клетки, инкубированные в отсутствие ротенона с концентрацией 0,15 мкг клеточного белка; Б - средняя ферментативная активность (ЕА) на мг белка в течение 16 мин. после инкубации клеток Bj в присутствии различных доз ротенона; контроль - без ротенона, 0,15 мкг клеточного белка Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 46 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Исходя из полученных данных, можно заключить, что добавление 1 и 5 мкМ ингибитора комплекса I ротенона приводит к значительному снижению ферментативной активности НАД-Н дегидрогеназы. Также происходит снижение жизнеспособности фибробластов линии Bj. Использование 0,5 мкМ конечной концентрации ротенона приводит к достоверному снижению ферментативной активности комплекса I и незначительному снижению жизнеспособности клеток линии Bj (рис. 7). А Б ф з ю о ?î £ Й S ? ь = S § 100 95 90 85 80 75 Контроль 0.5 мкМ 1 мкМ 5 мкМ с ф ю о 0 g 1 £ S I 5 § 5 - * л Ф ш о 5Є о. ф d о о 0.5 Рис. 6. Влияние различных доз ротенона на жизнеспособность фибробластов Bj; кКонтроль - без ротенона с конечной концентрацией 0,15 мкг клеточного белка. Достоверность по U-критерию Манна - Уитни *р< 0,05 Таким образом, оптимизированные протоколы иммуноблоттинга и измерения ферментативной активности комплекса I фибробластов Bj в совокупности с полученными данными позволят продолжить изучение метаболической и физиологической активности фибробластов в стрессовых условиях, моделирующих митохондриальные дисфункции при нейродегенеративных заболеваниях [21, 22]. В дальнейшем планируется провести модификацию функционирования митохондрий при нейродеге-неративной патологии с использованием новейших эпигенетических подходов, например, с помощью малых интерферирующих РНк с целью приостановления и реверсии заболевания [23]. Благодарности Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (ID RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

Об авторах

В. В Иванова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: Vilenavita@gmail.com

И. Г Старостина

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Е. В Мартынова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

С. П Перейра

Центр неврологии и клеточной биологии, Университет Коимбры

П. Дж Оливейра

Центр неврологии и клеточной биологии, Университет Коимбры

А. А Ризванов

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Список литературы

Дополнительные файлы