Expression of pluripotency transcription factors in human third molar tooth germ derived multipotent mesenchymal stromal cells transfected by plasmid pBud-Sox2-Oct4

Full Text

Введение Возможность возврата дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние впервые была показана K. Takahashi и S. Yamanaka в 2006 г. путем репрограммирования с помощью факторов транскрипции [1]. В начале 2007 г. было опубликовано три независимых исследования, в которых авторы продемонстрировали, что трансфекция культуры фибробластов четырьмя факторами транскрипции 0CT3/4, S0X2, C-MYC и KLF4 приводит к репрограммированию клеток и индукции плюрипотентного состояния [2-4]. Описанный подход получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) имеет большой потенциал для развития клеточной терапии различных заболеваний человека. ИПСК обладают свойствами эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и в экспериментах in vitro способны спонтанно дифференцироваться в эмбриональные клетки эктодермы, эндодермы и производные мезодермы На сегодняшний день для доставки кДНК генов факторов транскрипции в клетки-мишени применяют как вирусные векторные системы (в основном рекомбинантные ретровирусы), так и невирусные системы (например, доставка кДНК генов факторов e-mail: Albert.Rizvanov@kpfu.ru транскрипции в составе экспрессионных плазмид-ных векторов). Данные системы позволяют избежать онкогенных и иммуногенных свойств вирусных векторов, а также инсерционного мутагенеза Решающее значение для поддержания плюрипо-тентности ЭКС имеют факторы транскрипции S0X2 и 0CT4 Показано, что при снижении уровня экспрессии 0CT4 ЭСК дифференцируются в трофобласт-подобные клетки [5-6]. Ранее M. E. Yalvac с соавт. (2009) данной публикации показали, что пульпа зуба, в частности, пульпа зачатка третьего моляра человека (зуба мудрости), является источником «мультипотентных стволовых клеток» [7-8]. По своим морфологическим и фенотипическим свойствам эти клетки аналогичны мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК). Основным преимуществом для использования ММСК, выделенных из зачатков третьих моляров человека (ММСК-ЗТМ), является доступность биологического материала При определенных условиях культивирования ММСК-ЗТМ способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном, хондрогенном и нейрогенном направлениях, а также образовывать капилляро-подобные Гены & Клетки Том X, № 2, 2015 66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ структуры на Матригеле, что свидетельствует об их ангиогенном потенциале [8]. Эти свойства ММСК-ЗТМ открывают перспективы их использования в биомедицинских приложениях, таких как клеточной терапии и тканевой инженерии Последние исследования показали, что предшественниками значительной популяции ММСК в процессе развития зуба и регенерации, включающей производящие клетки пульпы и одонтобласты, являются клетки глии периферических нервов [9]. Стоит отметить, что эти данные отличаются от ранее выдвинутой теории о происхождении стволовых клеток «мягких тканей» зуба из клеток нервного гребня [10]. Все эти свойства позволяют предположить, вероятно, более выраженный регенеративный потенциал ММСК-ЗТМ с целью стимуляции посттравматиче-ской нейрорегенерации и терапии нейродегенера-тивных заболеваний в сравнении с ММСК жировой ткани и костного мозга, на сегодняшний день считающихся наиболее перспективными и имеющих другое эмбриональное происхождение по сравнению с ММСК пульпы зубов ММСК имеют потенциал трансдифференцировки в нейральную стволовую клетку Все эти свойства позволяют рассматривать ММСК зубов как один из источников клеточного материала для терапии нейротравм и нейродегенеративных заболеваний [11]. Ранее было показано, что ММСК-ЗТМ экспрессируют поверхностные антигены, характерные для ММСК, но не для гемопоэтических стволовых клеток [12]. Также было показано, что ММСК-ЗТМ имеют значительный уровень экспрессии мРНК генов c-myc и klf-4 в сравнении с ЭСК человека [8]. В настоящем исследовании для повышения плюрипотентного потенциала ММСК, выделенных из зачатков третьих моляров человека, нами был сконструирован экспрессионный плазмидный вектор pBud-Sox2-0ct4, одновременно экспрессирующий факторы транскрипции S0X2 и 0CT4. Исследована функциональность полученной экспрессионной плазмиды, а также жизнеспособность генетически модифицированных плазмидой pBud-Sox2-0ct4 ММСК-ЗТМ в подкожных имплантатах Матригеля® у лабораторных животных Материал и методы Создание экспрессионного плазмидного вектора Клонирование генов sox2 и oct4 человека осуществляли в несколько этапов. На первом этапе была проведена ОТ-ПЦР-амплификация кДНК соответ ствующих генов с использованием специфических праймеров (табл. 1) и ДНК-полимеразы PrimeSTART (Takara bio inc. ). В качестве источника РНК для ОТ-ПЦР амплификации гена oct4 использовали культуру ЭСК (линия hESM 01) [13]. В качестве матрицы для ПЦР-амплификации гена sox2 была использована плазмида с клонированной кДНК, любезно предоставленная проф. С. Л. Киселевым (Институт общей генетики им Н И Вавилова, Москва) На следующем этапе путем инкубации с GoTaq полимеразой (Promega) к 3' концам ПЦР-продуктов были добавлены аденозины После очистки ПЦР продуктов проводили TA-клонирование в вектор pGEM®-T Easy (Promega) в соответствии с инструкцией производителя. кДНК генов sox2 и oct4 из полученных плазмид pGEM-Sox2 и pGEM-0ct4 субклонировали в экспрессионный плазмидный вектор pBudCE4. 1 (Life Technologies) путем рестрикционного расщепления ферментами Kpni/Xhoi и Sali/Xbai (Promega), соответственно. Правильность сборки плазмидной конструкции pBud-Sox2-0ct4 подтверждали секвенированием с помощью стандартных вектор-специфичных праймеров на автоматическом секвенаторе ABi Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Культуры клеток ММСК были выделены из непрорезавшихся зачатков третьих моляров, извлеченных хирургическим путем у здоровых добровольцев (11-17 лет) как часть подготовительного лечения по ортодонти-ческим причинам Выделение ММСК проводили по методике, описанной ранее [7-8]. Для подтверждения функциональности плазмиды pBud-Sox2-0ct4 в работе использовали иммортали-зированную линию первичных эмбриональных клеток почки НЕК293 человека (human embryonic kidney 293 cells) (ATCC Number: CRL-11268). Культуры клеток ММСК-ЗТМ и НЕК293 поддерживали в среде DMEM (invitrogen, США), с содержанием сыворотки крови плодов коровы (fetal bovine serum, FBS) в конечной концентрации 10% (Sigma, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США) и 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) Инкубацию проводили при 37°С во влажной атмосфере и 5% содержанием СО2 Для генетической модификации клеток НЕК293 и МСК-ЗТМ экспрессионной плазмидой pBud-Sox2-0ct4 использовали трансфекционный агент TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции производителя Таблица 1. Праймеры, используемые для ОТ-ПЦР-амплификации специфических генов Название Нуклеотидная последовательность 5’^3’ Комментарии hSox2-ORFF-KpnI CACgGtaCCacCATGTACAACATGATGG Прямой/Первый раунд ОТ-ПЦР hSox2-ORFR-Stop-XhoI TCCtcgagTCACAT GT GTGAGAGGGGCAG Обратный/Первый раунд ОТ-ПЦР hOct4-6F(1st) GCAAGCCCTCATTTCACC Прямой/Первый раунд ОТ-ПЦР hOct4-1384R(1st) T GTGTCCCAGGCTT CTTTATT Обратный/Первый раунд ОТ-ПЦР hOct4v1-ORFF-BamHI-SalI GGGgatCcgtCgaCaCCATGGCGGGA Прямой/Второй раунд ПЦР hOct4v1-ORFR-Stop-XbaI- EcoRI CCCCATTCCTAGAgaattctctAgaT CAGTTT GAATGC Обратный/Второй раунд ПЦР Гены & Клетки Том X, № 2, 2015 оригинальные исследования 67 Иммуноблоттинг (вестерн блот анализ) Электрофорез белков лизатов клеток HEK293, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-0ct4, в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли [14]. Вестерн блот анализ белков был проведен с применением первичных поликлональных антител кролика к 0CT4 (0ct-3/4(H-134), sc-9081, Santa Cruz Biotechnology, разведение 1:500), поликлональных антител козла к S0X2 (Sox-2(Y-17), sc-17320, Santa Cruz Biotechnology, разведение 1:500) и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Anti-Goat IgG-HRP #A5420, Anti-Rabbit IgG-HRP #A0545, Sigma-Aldrich, разведение 1:2000). Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюми-несцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Германия). Люминесценцию детектировали на приборе ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур) Анализ экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в генетически модифицированных ММСК-ЗТМ Через 48 ч. после трансфекции клеточный осадок собирали с помощью центрифугирования. Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche) согласно инструкции фирмы производителя. мРНК, выделен ная из ЭСК человека hESM 01, была любезно предоставлена проф. С. Л. Киселевым (Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова, Москва) [13]. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора 0mniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen, США), согласно инструкции фирмы производителя Праймеры и пробы TaqMan для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) были разработаны с использованием программы PrimerExpress (Applied Biosystems, США) на основании нуклеотидных последовательностей генов-мишеней, полученных из базы данных GeneBank Пробы для ПЦР-РВ содержали 5'-концевую флуоресцентную метку FAM и 3'-концевой гаситель RTQ-1 Синтез праймеров и проб осуществляла компания Синтол (Москва, Россия) (табл. 2). Для ПЦР-РВ по технологии TaqMan применяли 2,5х реакционную смесь (Синтол, Россия) в соответствии с инструкцией производителя ПЦР-РВ для количественного анализа экспрессии мРНК генов факторов транскрипции и b-actin проводили на оборудовании iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), как описано ранее [8]. Реакции ПЦР-РВ выполняли в дубликатах Статистический анализ Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Excel 2007. Уровень экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в ЭСК считали за 100%. Таблица 2. Праймеры и пробы для ПЦР в режиме реального времени Название Нуклеотидная последовательность 5’^3’ h-ß-Actin-TMprobe CCAGCCAT GTACGTT GCTAT CCAGGC h-ß-Actin-TM-F GCGAGAAGATGACCCAGGATC h-ß-Actin-TM-R CCAGT GGTACGGCCAGAGG h-Oct4-TMprobe621 TCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGT h-Oct4-TM499F CGACCAT CT GCCGCTTT G h-Oct4-TM664R GCAAGGGCCGCAGCTTA h-c-Myc-TMprobe1494 TACGCAGCGCCTCCCTCCACTC h-c-Myc-TM1472F CGTCTCCACACATCAGCACAA h-c-Myc-TM1539R TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT h-Klf4-TMprobe1414 CCGGTT CCT GCAT GCCAGAGGA h-Klf4-TM1387F CGCTCCATTACCAAGAGCTCAT h-Klf4-TM1463R CGATCGTCTTCCCCTCTTTG h-Nanog-TMprobe453 TGCAGAGAAGAGT GTCGCAAAAAAGG h-Nanog-TM431F CCAAAGGCAAACAACCCACTT h-Nanog-TM499R T CTT GACCGGGACCTT GTCT h-Sox2-TMprobe763 CCGGCGGAAAACCAAGACGCT h-Sox2-TM717F TGCGAGCGCTGCACAT h-Sox2-TM809R GCAGCGT GTACTTATCCTT CTT CA Гены & клетки Том X, № 2, 2015 68 оригинальные исследования Трансплантация клеток лабораторным животным Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике Лабораторные крысы Rattus norvegicus линии Wistar были приобретены в питомнике лабораторных животных «Пущи-но» (Московская область). Животные содержались в питомнике Казанского государственного медицинского университета с неограниченным доступом к корму и воде Перед трансплантацией ММСК-ЗТМ метили флуоресцентным красителем PKH67 (зеленый спектр флуоресценции) в соответствии с инструкциями производителя (Sigma-Aldrich, США), который позволяет идентифицировать трансплантированные клетки в гистологических срезах Используемый флуоресцентный краситель позволяет проводить окрашивание мембран живых клеток (витальный краситель) без существенного влияния на их жизнеспособность и другие биологические свойства Генетически модифицированные ММСК-ЗТМ вводили крысам подкожно в виде суспензии в Ма-тригеле - компонент базальной мембраны, секрети-руемый клетками мышиной саркомы Энгельбрета - Хольма - Сварма. Эта смесь является аналогом внеклеточного матрикса и используется в экспериментальной биологии в качестве субстрата для культивирования клеток [15]. Для 1 инъекции 400 мкл холодного (4°С) Матри-геля (Matrigel™ Matrix, BD Biosciences, США) смешивали со 100 мкл суспензии клеток в культуральной среде. Инъекции проводили инсулиновым шприцем с иглой толщиной 23G таким образом, чтобы Матри-гель успевал полимеризоваться под кожей и образовывал желеобразный имплантат. Через 72 ч. после трансплантации импланты Матригеля изымали под наркозом (хлоралгидрат 6,4% раствор внутрибрю-шинно из расчета 400 мг/кг массы животного) и замораживали в жидком азоте в среде для заморозки тканей Richard-Allan Scientific™ Neg-50™ Frozen Section Medium (Thermo Fisher Scientific, США) для последующего приготовления срезов толщиной 5 мкм на криостате Microm HM560 (Thermo Scientific inc ) Флуоресцентный анализ Перед флуоресцентным анализом срезы фиксировали в 10% забуференном формалине (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. при комнатной температуре Далее срезы обрабатывали 0,1% раствором Тритона Х100 на TBS буфере в течение 20 мин Для визуализации ядер клеток срезы обрабатывали флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAP i, Sigma-Aldrich) в течение 10 мин при комнатной температуре После отмывки в TBS срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, Mounting Medium Vectashield™ (Vector Laboratories inc. ). Готовые препараты хранили при +4°С в темноте Полученные препараты анализировали при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio0berver. Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения AxyoVision Rel. 4. 8. Результаты и обсуждение Факторы транскрипции S0X2 и 0CT4 являются ключевыми регуляторами плюрипотентности. Коэк-спрессия S0X2 и 0CT4 начинается уже на стадии ранней морулы. Эти факторы обнаружены во внутренней клеточной массе бластоцисты Экспрессия обоих факторов происходит и в эпибласте [16]. Было показано, что ЭКС теряют способность к поддержанию плюрипотентности после нокдауна генов sox2 и oct4 путем РНК-интерференции [17]. Недавние исследования показали, что трансфекция стволовых клеток, выделенных из жировой ткани, с помощью кДНК генов sox2 и oct4 усиливает пролиферативную активность клеток и сокращает время перехода клеток от G1 до S клеточного цикла Кроме того у клеток со сверхэкспрессией факторов транскрипции S0X2 и 0CT4 способность к дифференцировке в адипоген-ном и остеогенном направлениях была выше, чем у контрольной группы клеток [18]. В связи с этим, для экспериментов по репрограммированию клеток мы создали экспрессионный плазмидный вектор, кодирующий кДНК генов sox2 и oct4. В результате ПЦР-амплификации и последующих этапов клонирования получен экспрессионный двухкассетный плазмидный вектор pBud-Sox2-0ct4 (рис. 1). Правильность сборки рекомбинантной плазмиды подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием (информация не приведена) Преимуществом данного вектора является одновременная и независимая экспрессия трансгенов, контролируемая промоторами CMV и EF-1a. Рис. 1. Схема двухкассетного плазмидного вектора pBud-Sox2-Oct4, сконструированного на основе вектора pBudCE4.1. Вектор одновременно и независимо экспрессирует факторы транскрипции SOX2 и OCT4 Для подтверждения экспрессии рекомбинантных генов полученной двухкассетной плазмидой проводили трансфекцию клеток HEK293 с использованием трансфекционного агента TurboFect. Анализ белковых лизатов генетически модифицированных клеток HEK293 показал наличие специфичных белковых полос на мембране с молекулярными массами 34 кДа и 48 кДа, что соответствует ожидаемым размерам факторов транскрипции S0X2 и 0CT4, Гены & клетки Том X, № 2, 2015 оригинальные исследования 69 соответственно (рис. 2). Таким образом, показано, что полученная двухкассетная генетическая конструкция pBud-Sox2-0ct4 экспрессирует факторы транскрипции S0X2 и 0CT4. А Sox2 Б Oct4 Рис. 2. Экспрессия рекомбинантных факторов транскрипции SOX2 2панель А, 34 кДа) и OCT4 2панель Б, 48 кДа) в клетках HEK293, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-Oct4: 1 - клетки HEK293, трансфицированные плазмидой pBud-Sox2-Oct4; 2 - нетрансфицированные клетки HEK293. Вестерн блот анализ В ходе работы были выделены ММСК из зачатка третьего моляра человека («зуба мудрости»). Известно, что для эффективного препрограммирования клетки необходим высокий уровень экспрессии четырех факторов транскрипции: C-MYC, KLF4, S0X2 и 0CT4. Ранее было показано, что ММСК-ЗТМ имеют значительный уровень экспрессии мРНК генов c-myc и klf4 в сравнении с ЭСК человека [8] Для повышения плюрипотентного потенциала ММСК-ЗТМ была проведена их генетическая модификация полученной генетической конструкцией pBud-Sox2-0ct4. Результаты количественного анализа экспрессии мРНК генов b-actin, oct4, c-myc, klf4, nanog, sox2 в ММСК-ЗТМ до и после генетической модификации плазмидой pBud-Sox2-0ct4 представлены на рис 3 Рис. 3. Уровень экспрессии мРНК генов nanog, oct4, c-myc, sox2, klf4 в ММСК-ЗТМ, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-Oct4. Уровень экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в ЭСК принят за 100%: 1 - нетрансфицированные ММСК-ЗТМ; 2 - ММСК-ЗТМ, трансфицированные плазмидой pBud-Sox2-Oct4. ПЦР-РВ Анализ проводили методом ПЦР-РВ. ММСК-ЗТМ, трансфицированные плазмидой pBud-Sox2-0ct4, показали значительное увеличение уровня мРНК генов sox2 и oct4, что свидетельствует о функциональности полученной целевой генетической конструкции in vitro. Также показано, что генетическая модификация ММСК-ЗТМ плазмидой pBud-Sox2-0ct4 приводит к увеличению экспрессии мРНК гена nanog. Это согласуется с данными, полученными нами при генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека плазмидой pBud-Sox2-0ct4. В результате трансфекции кДНК генов sox2 и oct4 наблюдалось увеличение уровня мРНК не только трансгенов, но и эндогенных мРНК генов klf4 и nanog [19]. Фактор транскрипции NAN0G является ранним регулятором плюрипотентности и трансрипционно регулируется непосредственно S0X2 и 0CT4. Факторы транскрипции S0X2, 0CT4 и NAN0G совместно регулируют многие гены, такие как yes1, fgf4, utf1, fbx15, zic3 и zfp206 [20]. Этим можно объяснить, что эктопическая экспрессия факторов транскрипции S0X2 и 0CT4 в ММСК-ЗТМ привела к увеличению экспрессии эндогенного уровня NAN0G. Это может свидетельствовать о запуске перепрограммирования ММСК-ЗТМ С целью исследования влияния генетической модификации на морфологию и жизнеспособность клеток, ММСК-ЗТМ были трансплантированы лабораторным крысам в составе Матригеля Для идентификации ММСК-ЗТМ в имплантатах Матригеля клетки перед трансплантацией метили витальным флуоресцентным красителем PKH67 Флуоресцентный анализ гистологических срезов имплантатов через 72 ч после трансплантации показал наличие жизнеспособных ММСК-ЗТМ (рис. 4). Рис. 4. Имплантаты из Матригеля® , содержащие клетки: А - ММСК-ЗТМ, генетически модифицированные плазмидой pBud-Sox2-Oct4; Б - нетрансфицированные ММСК-ЗТМ. Флуоресцентная микроскопия, докраска ядер DAPI 2синий). Окр.: PKH67 2зеленый). Ув. х200 Таким образом, генетическая модификация МСК-ЗТМ созданной рекомбинантной плазмидой pBud-Sox2-0ct4 приводит к увеличению экспрессии мРНК трансгенов sox2 и oct4, а также мРНК гена nanog. Данный факт может свидетельствовать о запуске процессов репрограммирования клеток, повышая их потенциал к дифференцировке в различных направлениях В связи с большим интересом к разработке генных и клеточных технологий для регенеративной медицины, подобные способы временной (транзи-торной) модуляции клеточного фенотипа могут лечь в основу новых методов лечения заболеваний человека

About the authors

V. V Solovyeva

Kazan (Volga Region) Federal University

N. L Blatt

Kazan (Volga Region) Federal University

D. S Guseva

Kazan State Medical University; Hannover Medical School

M. E Yalvac

Yeditepe University; Children’s Hospital Columbus

F. Sahin

Yeditepe University

R. R Islamov

Kazan State Medical University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga Region) Federal University

References

Supplementary files