Impact modified glial-derived neurotrophic factor (GDNF) for regeneration of epithelial and epithelial-stromal corneal defect in the experiment

Full Text

Введение По данным Всемирной организации здравоохранения, патология роговицы является причиной слепоты 5% населения мира. Из 314 млн пациентов 45 млн абсолютно слепые, из них 8,4 млн - дети [1]. e-mail: lkorochkin@mail.ru Одно из ведущих мест среди причин слепоты и слабовидения занимают рецидивирующие деструктивные процессы роговицы. Для решения данной проблемы безусловный интерес представляют нейротрофические факторы и, в частности, глиальный нейротрофический фактор (glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF). В исследованиях на клеточных культурах было установлено, что GDNF через многокомпонентную систему рецепторов стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов [2-4]. Система включает рецептор семейства GDNF альфа-1 (GDNF family receptor alpha 1, GFRa-1), рецептор с тирозинкиназной активностью (receptor tyrosine kinase, RET), MAP-киназный каскад сигнальных путей (mitogen-activated protein kinase, MAPK), регулируемый внеклеточным сигналом, ERK1/2 киназу (extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2) и Jun-N-концевую киназу (Jun N-terminal kinase 1/2, JNK1/2). Кроме того, GDNF способствует регенерации интрастромального и субэпителиального нервных сплетений роговицы после ее повреждения [5]. Однако имеющихся на сегодняшний день данных не достаточно для четкого представления о влиянии GDNF на регенеративный процесс в роговице. В частности, известно, что при повреждении роговицы увеличивается экспрессия трансформирующего фактора роста р-1 (Transforming growth factor р-1, TGF-P1), повышается активность TGF-P1, индуцируемого фосфорилирования JNK, и экспрессия фактора роста соединительной ткани, участвующего в процессах фиброзирования [6-8]. В связи с тем, что GDNF способен индуцировать фосфорилирование ERK и JNK, важно исключить возможное потенцирование неблагоприятных эффектов подобного рода при его применении. В процессах повреждения и регенерации роговицы значительную роль играют матричные металлопротеиназы (matrix metalloproteinase, MMP) и их ингибиторы (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP) [9, 10]. MMP при повреждениях регулируют процессы ремоделирования внеклеточного матрикса, в частности, ММР9 отвечает за деградацию поврежденного матрикса в процессе эпителизации и за ремоделирование стромы после ее завершения [11, 12]. Известно, что у пациентов с рецидивирующими эрозиями роговицы значительно повышен уровень ММР9. Предполагается, что с этим связан процесс деградации вновь образующейся базальной мембраны, т.е. избыточная экспрессия фермента может иметь патологические последствия [13]. В эксперименте при рецидивирующих эрозиях роговицы было выявлено, что повышение уровня ММР9 приводило к деградации абр4-интегрина и, соответственно, нарушению процессов миграции эпителиальных клеток и адгезии их к базальной мембране [14]. Так как GDNF в ряде случаев увеличивает экспрессию MMP9, с нашей точки зрения важно исключить возможное проявление неблагоприятных эффектов при его применении при повреждении роговицы. В лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН были получены и исследованы генетические конструкции, содержащие модифицированный ген gdnf - без пре- и пропоследовательностей. Культуральная среда, кондиционированная клетками, трансфицированными разработанными генными конструкциями, позитивно влияла на жизнеспособность и рост нервных отростков в культуре эмбриональных спинальных ганглиев, демонстрируя усиленные по сравнению с полноразмерной молекулой свойства GDNF [15]. Целью данной работы стало определение влияния модифицированного GDNF на процесс регенерации эпителиального и эпителиально-стромального повреждений роговицы в эксперименте. материал и методы Работу проводили на половозрелых самцах мышей линии C57BL/6J с экспериментальными моделями эпителиального и эпителиально-стромального повреждений роговицы. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996). Получение культуральной среды с модифицированным GDNF В качестве исследуемого препарата использовали кондиционированную среду, которую получали при культивировании клеток линии HEK293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), трансфицированных плазмидным вектором, содержащим модифицированный ген GDNF без пре- и про-последовательностей под цитомегаловирусным (CMV) промотором. Клетки линии НЕК293 сразу после трансфекции с помощью реагента ExGen 500 (Fermentas, США) по протоколу фирмы-производителя, рассевали в 25 см2 флаконы (Costar, США) и инкубировали 24 ч. в среде DMEM (Панэко, РФ), при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем кондиционированную среду отбирали из чашек, фильтровали через 0,22 мкм фильтр, замораживали и хранили при -20°С до использования. Контролем служила кондиционированная среда после культивирования интактных клеток линии HEK293. Экспериментальные модели эпителиального и эпителиально-стромального дефектов роговицы Для моделирования эпителиального дефекта животным под наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) в центре роговицы легким прижатием трепанов диаметром 1,5 (5 животных) и 2,5 мм (5 животных) наносилась метка, в пределах которой после окрашивания 0,01% раствором флюоресцеина (Sigma, США) удаляли эпителий с помощью скарификационного ножа. Для моделирования эпителиально-стромального дефекта в центре роговицы трепаном 1,5 мм производился разрез до 1/2 стромы, в пределах которого после окрашивания 0,01% раствором флуоресцеина удаляли эпителий с элементами 1/2 стромы роговицы (10 животных). После создания экспериментальной модели 2 раза в сут. проводили инстилляции в оба глаза каждого животного 0,3% раствора офлоксацина (флоксала) (Синтез, Россия). Кроме того, в один глаз (экспериментальная группа) вносили по 1 капле среды, кондиционированной трансфицированными HEK293 (расчетная доза GDNF - 0,01 мг в 1 капле), а в другой глаз (контроль) - по 1 капле среды инкубирования интактных клеток. Инстилляции указанными средами осуществляли каждые 3 ч. в течение 24 и 48 ч. при эпителиальном и эпителиально-стромальном дефектах, соответственно, а затем каждые 6 ч. в течение последующего наблюдения (3 нед. в случае эпителиальных, 10 сут. в случае эпителиально-стромальных дефектов). В ходе эксперимента у животных в течение 1 сут. после повреждения проводили анализ площади эпителиального дефекта роговицы. Для этого роговицу окрашивали флюоресцеином и фотографировали с помощью фотощелевой лампы BX 900, Haag-Streit IM (Швейцария). Область, окрашенную флуоресцеином, измеряли с использованием программного обеспечения ImageJ. У мышей при наличии эпителиального дефекта в центре роговицы через две недели после повреждения спонтанно развиваются эрозии в другой области, в основном в назальном квадранте. У животных с эпителиальным дефектом оценивали частоту формирования эрозий, наблюдая за состоянием роговицы в течение 3 нед. В случае эпителиально-стромального дефекта роговицы эрозии не развиваются, так как вследствие повреждения базальной мембраны активируется аВр4-интегрин, который стимулирует эпителиальную миграцию и формирование гемидесмосом, связывающих эпителиальные клетки с базальной мембраной [16]. В этой связи животных выводили из эксперимента на 5 сут. (5 животных) и на 10 сут. (5 животных), после чего проводили иммуногистохимическое исследование их роговицы. Иммуногистохимическое исследование Роговицу с прилежащей склерой отделяли от глазного яблока и фиксировали в 4% растворе формальдегида, приготовленном на физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS, pH 7,3), в течение 24 ч. при 4°С. После пропитки в 30% растворе сахарозы в PBS в течение 1 ч. роговицы замораживали в криостате. Срезы толщиной 10 мкм размещали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Cрезы, окруженные гидрофобной полоской, 1 ч. инкубировали в 2% растворе нормальной сыворотки крови осла (Jackson ImmunoResearch, США) в PBS с добавлением детергента Triton X-100 (Sigma, США) при комнатной температуре. Затем срезы покрывали раствором первичных антител в том же растворителе в течение ночи при 4°С. После промывки в PBS срезы в течение 1 ч. инкубировали в растворах ослиных антител к иммуноглобулинам животных-хозяев первичных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями Cy2 и Texas red. Срезы покрывали глицерином и покровными стеклами и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CX-41 с флуоресцентной насадкой и цифровой фотокамерой Nikon D5300 (КНР). «Неинформированный оператор» анализировал одинаково экспонированные цифровые микрофотографии и оценивал уровень экспрессии исследованных антигенов в эпидермальных и стромальных компонентах роговицы по 5-балльной шкале. Различия в интенсивности иммуногистохимической окраски между роговицами контрольной и экспериментальной групп оценивали по средним баллам оценки. Достоверность различий определяли с помощью одностороннего критерия ANOVA, применяя программу GraphPad-Prism. В работе использовали кроличьи антитела к рецептору GDNF GFRa1, кроличьи антитела к анти-апоптозному фактору Bcl2 и его антагонисту Bax, мышиные антитела к металлопротеиназе ММР9 и цитокератинам 5 и 18 типов (Abcam, Великобритания), мышиные антитела к ERK1/2, JNK1/2, фосфо-ERK1/2 и фосфо-JNK1/2, козьи антитела к TGF-p, TIMP1 и c-Met (Santa Cruz, США), а также кроличьи антитела к белковому маркеру пролиферации Ki67 (Novocastra, Великобритания). Чтобы подтвердить наличие базальной мембраны, производилось исследование с кроличьими антителами к ламинину и аВр4-интегрину (Abcam, Великобритания). Для оценки реиннервации срезы инкубировали с куриными антителами к GAP43 (Acris Antibodies, Германия). результаты Макроскопические данные Площадь эпителиального дефекта роговицы через 6, 12 и 21 ч. при 1,5 мм деэпителизации в экспериментальной группе составляла 62, 30 и 5% от исходной площади, через 1 сут. наблюдалась полная эпителизация роговицы. В контроле площадь дефекта через те же промежутки времени составляла 70, 55 и 25%, через 1 сут. - 6% (рис. 1А). При деэпи-телизации диаметром 2,5 мм площадь эпителиального дефекта роговицы через 12 и 24 ч. составляла в экспериментальной группе 50 и 8%, в контроле - 70 и 25% от исходной площади (рис. 1Б). Формирование эрозий роговицы в экспериментальной группе после деэпителизации диаметром 1,5 и 2,5 мм наблюдалось в 30 и 35% случаев, соответственно, в контроле - в 80 и 85%. Иммуногистохимическое исследование После эпителиально-стромального повреждения в базальном слое эпителия лимбальной зоны роговицы в обеих группах была выявлена позитивная реакция с антителами к GFRa1, что доказывает наличие рецепторов GDNF. Интенсивность реакции с антителами к общим ERK1/2 и JNK1/2 в экспериментальной группе не отличалась от контроля. Реакция с антителами к фосфо-ERKI^ в первой группе была более интенсивной в эпителии, а к фосфо-JNKI^ в строме роговицы на 5 и 10 сут. после повреждения (рис. 2). Полученные результаты свидетельствуют о повышении пролиферативной активности эпителиоцитов и кератоцитов через MAP-киназный каскад сигнальных путей. Выраженная позитивная реакция в экспериментальной группе на 5 и 10 сут. с антителами к Ki67 являлась подтверждением пролиферативной активности эпителиальных клеток и кератоцитов: на 5 сут. Ю67-иммунопозитивными были 14,9±2,3% клеток стромы и 5,2±2,0% клеток эпителия, тогда как в контроле - 4,7±1,4% и 1,0±0,4%, соответственно; на 10 сут. в экспериментальной группе - 6,5±2,1% клеток стромы и 2,2±0,3% клеток эпителия, в контроле - 1,6±0,4% клеток стромы, а в эпителии Ю67+-клетки не определялись. Различия между группами были статистически значимы (p<0,05). В экспериментальной группе на 5 сут. была показана более выраженная, по сравнению с контролем, позитивная реакция с антителами к цитокератинам 5 и 18 типов во всех слоях сформированного эпителия, что свидетельствует об активной экспрессии свойственных ему типов промежуточных микрофи-ламентов, его функциональной зрелости и физиологическом характере эпителизации (рис. 2, 3). 0 12 ч. 24 ч. II II Рис. 1. Размеры эпителиальных дефектов роговицы в экспериментальной (I) и контрольной (II) группах в течение первых суток после повреждения: А - при начальной деэпителизации диаметром 1,5 мм, Б - при начальной деэпителизации диаметром 2,5 мм Эпителий роговицы, 5 сут. Эпителий роговицы, 10 сут. Рис. 2. Результаты балльной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции эпителия и стромы роговицы с антителами к ММР9, цитокератинам 5 и 18 типов, pERK1/2, p JNK1/2, TGF-p, TIMP1, c-Met, Bcl2 и Bax на 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения в экспериментальной (I) и контрольной (II) группах ■ I all А Б Рис. 3. Экспрессия цитокератинов 5 и 18 типов в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок - 50 мкм В контрольной группе на 5 сут. реакция с антителами к цитокератинам 5 и 18 типов в эпителии роговицы была неравномерно позитивной, что коррелирует с неравномерностью процесса эпителиза-ции. Наблюдаемая позитивная реакция в базальной мембране и поверхностных слоях стромы могла быть обусловлена активной эпителиальной миграцией с формированием содержащих эпителиальные клетки полостей (псевдокист). На 10 сут. в экспериментальной группе, в отличие от контроля, наблюдалась полная эпителизация роговицы (рис. 2, 3). На 5 сут. в области базальной мембраны в экспериментальной группе была выявлена равномерная позитивная реакция с антителами к коллагену IV типа, который способствует адгезии эпителиальных клеток, в контроле реакция была неравномерной. В экспериментальной группе на том же сроке в эпителии была выявлена более интенсивная позитивная реакция с антителами к c-Met-рецептору фактора роста гепатоцитов (рис. 2, 4). Известно, что фактор роста гепатоцитов (HGF) с паракринным механизмом действия секретируется в клетках стромы роговицы и взаимодействует с ^Met-рецептором эпителиальных клеток. Под воздействием HGF-конвертирующего белка, вырабатываемого при повреждении роговицы, HGF секретируется более активно [17-19]. В результате связывания HGF с ^Met-рецептором и активирования МАР-киназного (ERK1/2) и фосфатидилинозитол-3-киназного (PI3K/AKT) путей реализуется его антиапоптотиче-ский механизм действия и активируются процессы пролиферации и миграции эпителиальных клеток [20-23]. Наличие позитивной реакции к с-Met в строме роговицы в контроле на 5 и 10 сут. может быть также связано с процессом активной эпителиальной миграции в строму и ее ремоделированием. АБ Рис. 4. Экспрессия с-Met в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок - 50 мкм Реакция с антителами к Bcl2 в эпителии роговицы в экспериментальной группе была более интенсивной, чем в контроле, как на 5, так и на 10 сут. после повреждения (рис. 2, 5). Напротив, реакция с антителами к Bax в эпителии роговицы была более выраженной в контрольной группе. Наличие высокого уровня антиапоптозных маркеров в экспериментальной и проапоптозных в контрольной группах может свидетельствовать об антиапоптотическом эффекте GDNF (рис. 2, 6). Реакция с антителами к матриксной ММР9 на 5 и 10 сут. была более интенсивной в эпителии роговицы в контроле. ММР9 способствует разрушению базальной мембраны и, как было сказано выше, может приводить к деградации аВр4-интегрина, нарушению процессов миграции эпителиальных клеток и механической адгезии их к базальной мембране (рис. 7). Реакция с антителами к ингибитору металлопротеиназ Т1МР-1 была более выраженной в эпителии, базальной мембране и прилежащих слоях стромы роговицы глаз контрольной группы на 5 сут. и во всех слоях стромы на 10 сут. Для нормального гомеостаза в тканях необходимо сбалансированное взаимодействие MMP и TIMPs, а любое нарушение этого баланса может привести к избыточной или недостаточной деградации внеклеточного матрикса. Избыток TIMP1 в контроле, таким образом, может свидетельствовать об аномальном накоплении матрикса, что наблюдается при процессах, связанных с фиброзом. Слабая реакция с антителами к TGF-p была выявлена в роговице глаз экспериментальной группы, более интенсивная - в контроле на 5 и 10 сут., что подтверждает более выраженный процесс фиброзирования в контрольной группе. А Рис. 5. Экспрессия Bcl2 в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок - 50 мкм Б А Рис. 6. Экспрессия Bax в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок - 50 мкм Б А Б Рис. 7. Экспрессия ММР9 (красный) и GAP43 (зеленый) в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок - 50 мкм В экспериментальной группе на 10 сут. в строме роговицы выявлено значительно большее количество САР43-иммунопозитивных нервных волокон, чем в контроле: 1150±336 и 376±156 волокон на 1 мм2 среза, соответственно. Это свидетельствует об интенсификации процесса формирования стромального нервного сплетения под влиянием GDNF (рис. 7). Различия между группами по реакции на GAP43 были статистически значимы (p<0,05). обсуждение В результате исследования на экспериментальной модели эпителиального дефекта роговицы установлено, что кондиционированная среда культивирования клеток HEK293, продуцирующих модифицированный GDNF, стимулирует процесс эпителизации и сокращает частоту формирования эрозий после деэпителизации. В результате клинико-морфологического исследования на экспериментальной модели эпителиально-стромального дефекта роговицы доказано, что применение GDNF стимулирует не только эпители-зацию, но и способствует восстановлению стромы роговицы. Через систему рецептора GFRa-1 и MAP-киназный каскад сигнальных путей GDNF стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов за счет активного фосфорилирования ERK1/2 в эпителии и умеренного фосфорилирования JNK1/2 в строме. Полученные результаты подтверждают данные работ, проведенных на клеточных культурах, в которых было установлено, что GDNF через GFRa-1 и MAP-киназный каскад сигнальных путей стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов [2-4]. GDNF является представителем надсемейства TGF-p, одного из надсемейств нейротрофических факторов [24]. В связи с этим, механизмы действия GDNF и TGF-p обладают, в определенной степени, синергизмом. Помимо канонического каскада Smad-белков TGF-p, также как и GDNF, активирует MAP-киназный каскад сигнальных путей и стимулирует клеточную пролиферацию [25]. Как было сказано выше, при повреждении роговицы увеличивается экспрессия TGF-pi и повышается активность TGF-pi-индуцированного фосфорилирования JNK [6-8]. Стимулируя формирование внеклеточного матрикса, пролиферацию фибробластов и их дифференцировку в миофибробласты, TGF-p играет ключевую роль в процессах фиброзирования. Было установлено, что при стромальном повреждении роговицы и увеличении экспрессии TGF-p в эпителии и строме роговицы, увеличивается количество фибробластов, объем внеклеточного матрикса и развивается фиброз, при применении же антител к TGF-p процесс фиброзирования сокращается [26, 27]. Наличие слабой реакции с антителами к TGF-p в роговице экспериментальной группы свидетельствует о слабом ингибирующем влиянии GDNF на экспрессию TGF-p (этим также может быть обусловлено умеренное фосфорилирование JNK1/2 в строме роговицы) и его антифибротическом механизме действия. Кроме этого, антифибротический механизм действия GDNF обеспечивается за счет ингибирования TIMP1 и предотвращения избыточного накопления внеклеточного матрикса. GDNF стимулирует в эпителии роговицы экспрессию c-Met-рецептора, который играет важную роль в процессах эпителизации. Установлено, что при повышенной экспрессии c-Met-рецептора в роговице, связанной с RAV-^Met трансдукцией роговицы, сокращается время эпителизации при повреждении [28] и, наоборот, у с-Met мутантных мышей нарушается процесс реэпителизации при повреждениях кожи [29]. В результате взаимодействия c-Met-рецептора с HGF, который активируется при повреждении [17-19], могут быть реализованы его основные механизмы действия - антиапоптотический и активации процессов пролиферации и миграции эпителиальных клеток [20-23]. Кроме того GDNF, предотвращая процесс эпителиальной миграции в строму роговицы, обеспечивает нормальный характер регенерации. В результате равномерного активного формирования коллагена IV типа в области базальной мембраны GDNF способствует адгезии эпителиальных клеток. В результате нейтрализации ММР9 GDNF предотвращает ее возможные негативные эффекты - деградацию вновь образующейся базальной мембраны, нарушение процессов миграции эпителиальных клеток и механической адгезии их к базальной мембране [13, 14]. При использовании культивированных аллогенных фибробластов в коллагеновом геле при ожоговых дефектах роговицы авторами было также установлено, что снижение экспрессии ММР9 способствует процессу регенерации [30]. В процессе эпителизации при применении модифицированного GDNF в эпителии роговицы активно экспрессируются цитокератины 5 и 18 типов. Установлено, что в норме в эпителии роговицы, как в центре, так и на периферии равномерно интенсивно экспрессируются цитокератины 3, 5 и 14 типов и незначительно меньше в центре, чем на периферии - цитокератины 18 типа [31]. Цитокератины принадлежат к семейству промежуточных микрофиламен-тов и поддерживают целостность эпителия роговицы за счет механической прочности самих клеток и формирования межклеточных контактов. В связи с этим, полученные результаты свидетельствуют о повышении прочности эпителиального слоя в процессе его формирования в присутствии GDNF. О выраженном антиапоптотическом действии GDNF в процессе эпителизации роговицы свидетельствует повышение уровня антиапоптозного фактора Bcl2 и снижение уровня проапоптозного Bax. Для процессов как физиологического обновления эпителия, так и его регенерации при повреждении необходимо наличие баланса между этими факторами в роговице [32]. Анализ GAP43 иммунопозитивных структур показал, что GDNF значительно ускоряет восстановление стромального нервного сплетения после эпителиально-стромального дефекта роговицы. Известно, что для жизнеспособности различных нейрональных популяций необходимо наличие синергизма между GDNF и другими факторами - нейротрофическим фактором головного мозга для сенсорных нейронов, выделенных из нодозных и височных ганглиев, цилиарным нейротрофическим фактором для фоторецепторов, инсулиноподобным фактором роста 1 для мотонейронов, TGF-p для эмбриональных куриных ганглиев [33-36]. По результатам наших исследований использование GDNF при эпителиально-стромальном дефекте роговицы ингибирует уровень экспрессии в роговице TGF-p. В этой связи, для восстановления стромального нервного сплетения наличие TGF-p или не требуется, или его незначительного количества достаточно, как для жизнеспособности куриных цилиарных нейронов [37]. Выводы 1. Модифицированный GDNF стимулирует процесс эпителизации и сокращает частоту формирования эрозий после деэпителизации роговицы. 2. Модифицированный GDNF стимулирует пролиферативную и миграционную активность эпителиальных клеток и процесс эпителизации, предотвращает процесс деградации вновь образующейся базальной мембраны, способствует адгезии к ней эпителиальных клеток, проявляет антифибротические и анти-апоптотические свойства, стимулирует восстановление стромального нервного сплетения. 3. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения кондиционированной среды культивирования клеток HEK293, продуцирующих модифицированный GDNF, при повреждениях роговицы. Однако необходимы дальнейшие исследования с целью разработки и тестирования методов терапевтического использования препаратов на основе данного нейротрофического фактора. Благодарности Работа выполнялась при финансировании гранта РНФ № 14-15-00942.

About the authors

N. A Gavrilova

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Moscow, Russia

A. V Revischin

Institute of Gene Biology of RAS

Moscow, Russia

S. A Borzenok

S.N. Fedorov Eye Microsurgery Interdisciplinary Science and Technology Complex; S.N. Fedorov Eye Microsurgery Interdisciplinary Science and Technology Complex

Moscow, Russia

O. J Komova

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Moscow, Russia

M. B Agammedov

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Moscow, Russia

H. D Tonaeva

S.N. Fedorov Eye Microsurgery Interdisciplinary Science and Technology Complex

Moscow, Russia

D. S Ostrovsky

S.N. Fedorov Eye Microsurgery Interdisciplinary Science and Technology Complex

Moscow, Russia

G. V Pavlova

Institute of Gene Biology of RAS

Moscow, Russia

References

Supplementary files