Biocompatibility and osteoplastic properties of mineral polymer composite materials based on sodium alginate, gelatin, and calcium phosphates intended for 3D-printing of the constructions for bone replacement

Full Text

Введение Разработка биоматериалов, предназначенных для восстановления костных дефектов, остается актуальной медицинской и социально-значимой задачей, что обусловлено, с одной стороны, распространенностью патологических состояний костной ткани, возникающих в результате травм, опухолевого поражения, дегенеративных возрастных изменений, пороков развития, а с другой - старением населения в целом. Кроме того, эффективность лечения пациентов даже с переломами костей скелета некоторых локализаций остается не достаточно эффективной. В частности, не более 1/3 всех переломов костей голени у взрослого населения завершается полным выздоровлением c хорошим функциональным исходом [1]. Несмотря на тот факт, что спектр разрабатываемых остеопластических материалов довольно разнообразен (натуральные материалы, синтетические полимеры, кальцийфосфатная керамика, биоситаллы) [2, 3], ведется непрерывный поиск как новых биоматериалов, так и способов формирования имплантатов для замещения костных дефектов. Современные методы получения остеопластических материалов во многом базируются на фундаментальных представлениях о физиологии и композиционной структуре межклеточного вещества костной ткани, состоящего из коллагеновых фибрилл и биологического апатита. Исходя из этого, весьма перспективным представляется использование многокомпонентных композиционных материалов и, в частности, минерал-полимерных композитов [4]. Среди полимеров особый интерес представляют биосовместимые полисахариды - альгинат (Ал) и желатин (Жел) [5], из фосфатов кальция - керамика на основе трикальцийфосфата (ТКФ) и октакальциевого фосфата (ОКФ), в силу того обстоятельства, что эти материалы обладают относительно высокой растворимостью в жидкостях организма, а ОКФ, будучи предшественником биологического апатита, способствует процессу биоминерализации формирующейся костной ткани [6]. Сочетание уникальных свойств минерал-поли-мерных композитов с возможностями быстрого прототипирования (30-печати) создает предпосылки для значительного улучшения технологий тканевой инженерии костей, а также открывает возможности персонализации имплантатов в соответствии с геометрией дефекта [7, 8]. Ранее нами были изучены микроструктура, фазовый состав, а также цитосовместимость конструкций на основе альгината натрия и различных типов фосфатов кальция, полученных методом 30-печати [9]. Исследованные конструкции обладали слоистой структурой альгината натрия с вкраплениями гранул фосфатов кальция при сохранении их исходного фазового состава. Была продемонстрирована хорошая цитосовместимость изделий в сочетании с удовлетворительными адгезионными свойствами поверхности. По совокупности ранее опубликованных данных, для дальнейших исследований in vivo мы отобрали композитные материалы с двумя видами фосфатов кальция - Ал-ТКФ и Ал-ОКФ, дополнив каждый из них желатином в целях улучшения механических свойств материалов. материал и методы Методика получения трехмерных конструкций Технология трехмерной струйной печати конструкций на лабораторной установке ИПЛИТ 50/01 была описана нами ранее [9]. В качестве «чернил» использовали композиционный гидрогель на основе 2% Ал (CAS 9005-38-3, Acros), 10% водного раствора Жел (Gelatine 80-100, 142060.1211, Blooms) с 10-30 масс. % гранулированных (100-200 мкм) фосфатов кальция: ТКФ и ОКФ, полученных по описанной ранее керамической технологии [10]. По завершении процесса печати трехмерные конструкции помещали на 1 ч. в морозильную камеру (-50°C), далее подвергали сублимационной сушке и затем обрабатывали сшивающим агентом (10% раствор хлорида кальция, 1 ч., 35-37°C). Образцы «сшитых» трехмерных конструкций помещали в термостат (37°C) до полного высыхания. Для повышения прочности конструкций проводили их дополнительную 2-3 кратную «принудительную усадку» путем обработки водно-спиртовым (3/7) раствором в течение 1 ч. с повторной сушкой в термостате (37°C). Стерилизацию образцов осуществляли у-облучением (15 кГр). Физические исследования трехмерных конструкций Физические исследования изделий включали оценку их микроструктуры на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) Vega II SBU (Tescan, Чехия) и прочностных характеристик (прочность на сжатие, растяжение) на электродинамической испытательной системе ElectroPuls E3 000 ( Instron, США). Исследование биосовместимости трехмерных конструкций in vivo Биосовместимость трехмерных конструкций оценивали в модели подкожной имплантации мышам-самцам линии B0F1 (Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России, филиал «Андреевка»). Все эксперименты с мелкими лабораторными животными проводили с соблюдением принципов гуманности и требований, сформулированных в Директивах Совета Европейского Сообщества 2010/63/EU «Об использовании животных для экспериментальных исследований». На протяжении всех исследований животных содержали в виварии в условиях стандартного светового, пищевого и водного режима. Непосредственно перед оперативным вмешательством образцы конструкций экспонировали в физиологическом растворе. Техника операции была описана нами ранее [11]. Мышам под наркозом (внутрибрюшинно по 0,1 мл смеси кетамина/рела-ниума в отношении 1:1) вводили по 1 образцу стерильного трехмерного изделия под кожу спины на уровне грудного отдела позвоночника. Было сформировано 4 группы по 10 животных по количеству составов имплантируемых образцов трехмерных конструкций. Через 2, 4, 8 и 12 нед. после операции мышей выводили из эксперимента (по два животных на каждый срок), образцы материалов извлекали, проводили их визуальную оценку (видеокомплекс на основе стереомикроскопа и цифровой видеокамеры Olympus, Япония), после чего фиксировали в 10% растворе формалина и изготавливали парафиновые блоки. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Фотографирование гистологических препаратов осуществляли при помощи микроскопа Axiovert 40C, оснащенного цифровой камерой Axiocam MR3 (Zeiss, Германия). Исследование остеопластических свойств прототипов трехмерных конструкций в модели дефекта бедренной кости Ортотопическая имплантация выполнена на крысах-самцах линии Wistar, массой 180-200 г (Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, филиал «Андреевка») с соблюдением перечисленных выше принципов и норм гуманного обращения с животными. Операцию с формированием «окончатого» дефекта большеберцовой кости осуществляли под наркозом. Ход операции был описан нами ранее [11]. Параметры костного дефекта: длина 6-8 мм, ширина 1,5-2,0 мм, глубина 1,5-2,0 мм с проникновением в костномозговой канал и эвакуацией костного мозга. В область дефекта вводили стерильные образцы трехмерных конструкций следующих составов: Ал-ТКФ, Ал-ОКФ, Ал-Жел-ТКФ и Ал-Жел-ОКФ. Всего было сформировано 4 группы животных (n = 10). Через 3, 6, 9 и 12 нед. по 2 животных выводили из эксперимента. Фрагменты тканей, включающие зону дефекта, фиксировали в 10% растворе формалина (7 сут.), далее декальцинировали в ЭДТА (0,3 М; 37°С; 25-30 сут.), регулярно обновляя декальцинирующую жидкость. После достижения материалом выраженной эластичности изготавливали парафиновые блоки, затем - срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и осуществляли световую микроскопию. Статистическая обработка полученных результатов Обработку результатов проводили с использованием стандартных методов описательной статистики в программе «Microsoft Excel 2000». Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием непараметрического U-критерия Манна - Уитни с уровнем значимости р = 0,05. результаты и обсуждение Состав, структура и физические свойства изделий Методом струйной 30-печати были получены прототипы трехмерных конструкций для замещения костных дефектов 4 различных составов: Ал-ТКФ, Ал-Жел-ТКФ, Ал-ОКФ, Ал-Жел-ОКФ. Изделия имели форму цилиндров с диаметром 4,0-4,5 мм, высотой 3-4 мм и весом 3,5-4,4 мг (рис. 1). При анализе изображений СЭМ установлено, что трехмерные конструкции всех 4 составов, вне зависимости от вида фосфатов кальция, имели нерегулярную пластинчатую структуру альгинатной составляющей с толщиной пластин ~2-3 мкм, размером пор между ними около 500 мкм и близкую к сферической форму керамических гранул фосфатов кальция. Добавление Жел в состав «чернил» не влияло на микроструктуру конструкций и не вносило существенных изменений в размер и пространственную организацию внутренних пор (рис. 2). Учитывая тот факт, что пористость биоматериалов во многом определяет эффективность их заселения клетками, доставку питательных веществ, газов и скорость прорастания кровеносными сосудами после их имплантации in vivo, мы более детально исследовали пористость композитов разных составов. Установлено, что общая пористость образцов трехмерных каркасов снижалась с увеличением доли фосфатов кальция в композите, составляя 81,98% и 63,92% - для 10 и 30 масс. % ТКФ в образцах, соответственно (табл. 1). Статистически значимое увеличение размера пор конструкций, напечатанных из Ал и 30 масс. % ТКФ, отмечалось при введении в состав композитов Жел. При сравнительном исследовании механических свойств конструкций установлено, что прочность при сжатии монотонно возрастала, а прочность на растяжение снижалась с увеличением доли гранул ТКФ в композитах (табл. 2). Введение в состав композита Жел достоверно увеличивало его прочность при сжатии (с 3,53±0,39 до 5,28±0,020 МПа), практически не влияя на прочность при растяжении. Рис. 1. Внешний вид прототипа трехмерной конструкции на основе Ал-ТКФ: А - вид сверху, Б - вид сбоку Рис. 2. Трехмерные конструкции различных составов: А - Ал-ТКФ 30 масс. %; Б - Ал-Жел(90/10)-ТКФ 30 масс. %. Сканирующая электронная микроскопия. Ув. х100 таблица 1. Структура образцов трехмерных матриксов на основе Ал-ТКФ с добавлением Жел № партии образцов Состав образцов Общая пористость образцов (%), M±m Размер пор, ШхД, мкм 1 Ал-ТКФ - 10 масс. % 81,98±0,28 400х500 2 Ал-ТКФ - 20 масс. % 75,06±0,62 400х500 3 Ал-ТКФ - 30 масс. % 63,92±2,33 300х600 4 Ал-Жел-ТКФ - 30 масс. % 68,23±0,94 600х800 таблица 2. Прочностные характеристики трехмерных конструкций различных составов № партии образца Состав образца асж, МПа M±m 8, % M±m 1 Ал-ТКФ - 10 масс.% 2,71±0,12 15,4±0,16 2 Ал-ТКФ - 20 масс.% 3,01±0,13 13,8±0,11 3 Ал-ТКФ - 30 масс.% 3,53±0,39 12,4±0,35 4 Ал-Жел-ТКФ - 30масс. % 5,28±0,020 12,2±0,16 Примечание: осж - прочность при сжатии, МПА; 8 - прочность при растяжении, %. Биосовместимость в гетеротопических условиях При анализе биологической совместимости конструкций в модели их подкожной имплантации мы исходили из того, что выраженность тканевой реакции организма и ее морфологические особенности напрямую зависят от природы и химического состава имплантированных материалов, а также их токсичности и иммуногенности для организма. Основными признаками, учитываемыми в ходе гистологического анализа, являлись степень интеграции с окружающими тканями, особенности соединительнотканной капсулы и ее васкуляризация, а также наличие/от-сутствие воспаления [12]. Дополнительными характеристиками степени биосовместимости стали количество клеточных слоев в капсуле, признаки биодеградации имплантата и характеристика ткани, замещающей имплантат. В зоне имплантации трехмерных конструкций состава Ал-ТКФ на ранних (2 нед.) сроках выявлена достаточно тонкая (до 8-10 слоев клеток) фиброзная капсула с концентрически ориентированными волокнами соединительной ткани, прорастающая кровеносными сосудами (рис. 3А). С первых недель после имплантации отмечен активный процесс фрагментации альгинатной составляющей композита, миграция в зону, занятую конструкцией, фибробластов и заполнение пространств между гранулами ТКФ и фрагментами альгината реактивно измененной рыхлой волокнистой соединительной тканью (рис. 3А). Через 8-12 нед. количество соединительной ткани внутри имплантата заметно увеличивалось (рис. 3Б). Отмечалось появление в новообразованной соединительной ткани гигантских клеток инородных тел в сочетании с уменьшением размеров гранул ТКФ, что указывало на начало процесса биодеградации образцов. Добавление в состав композита Жел ускоряло процесс его биодеградации и замещения имплантата соединительной тканью, что было заметно уже на ранних (2 нед.) сроках наблюдения и четко вырисовывалось к 12 нед. (рис. 3В, Г). 2 нед 12 нед Рис. 3. 30-конструкции различного состава, имплантированные подкожно: А, Б - Ал-ТКФ; В, Г - Ал-Жел-ТКФ; Д, Е - Ал-ОКФ; Ж, З - Ал-Жел-ОКФ. А, В, Д, Ж - 2 нед.; Б, Г, Е, З - 12 нед. после подкожной имплантации. Окр.: гематоксилин и эозин. Ув. х100 Несколько иная картина прослеживалась при исследовании биосовместимости конструкций, в которых фосфаты кальция были представлены ОКФ. Капсула вокруг такого типа изделий на ранних сроках была представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью с правильной ориентацией волокон, нейтрофильной инфильтрацией и активной васкуляризацией (рис. 3Д). Через 12 нед. после операции асептическое воспаление в зоне имплантации стихало (рис. 3Е). Прослеживалась постепенная «инволюция» конструкции, выражающаяся в активном замещении его компонентов - как Ал, так и ОКФ - соединительной тканью с фибробластоподобными клетками и гигантскими многоядерными клетками инородных тел и сравнительно небольшим количеством сосудов. Необходимо отметить, что скорость замещения имплантата соединительной тканью была максимальной для конструкций тройного состава - Ал-Жел-ОКФ (рис. 3Ж, З). Таким образом, в эксперименте in vivrj на модели подкожной имплантации все 4 типа конструкций «продемонстрировали» биосовместимость. При этом была отмечена более высокая скорость деградации ОКФ по сравнению с ТКФ, а также ускоренная фрагментация пластин Ал в присутствии Жел, что приводило к более интенсивному замещению имплантатов соединительной тканью. Признаков остеогенеза не наблюдалось. Биологическое действие в ортотопических условиях Оценку остеозамещающих потенций композиционных 30-конструкций осуществляли в модели дефекта большеберцовой кости крыс. Через 3 нед. после имплантации изделия из Ал и ТКФ уже выявлялось начало резорбции пластин Ал с замещением их волокнистой соединительной тканью с фибробластоподобными клетками и формированием ячеистой структуры. На границе со здоровой костью в эти сроки визуализировались отдельные очаги периостального остеогенеза, а по всей площади среза - многочисленные кровеносные сосуды (рис. 4А). Рис. 4. Регенерат в зоне имплантации конструкций из Ал-ТКФ (А, Б, В) и Ал-Жел-ТКФ (Г, Д, Е) в дефект большеберцовой кости крысы: А, Г, Д - 3 нед., Б - 6 нед., В - 9 нед., Е - 12 нед. после операции. Окр.: гематоксилин и эозин. Ув. х100 Через 6 нед. на периферии дефекта отмечено формирование волокнистой гиперплазированной, богатой фибробластоподобными клетками соединительнотканной капсулы, переходящей в надкостницу. В толще имплантата к периостальному добавлялся энхондральный остеогенез, а в интермедиарной зоне выявлялись новообразованные костные трабекулы (рис. 4Б). При более длительном наблюдении (9 и 12 нед. после операции) процесс репаративной регенерации продолжался. С одной стороны, место дефекта оставалось заполненным волокнистой соединительной тканью, в которой определялись участки новообразованной пластинчатой костной ткани. С другой стороны, на границе между компактным и губчатым веществом костной ткани гранулы ТКФ постепенно замещались костными балками с отдельными очагами гемопоэза между ними (рис. 4В). Введение Жел в состав композита (Ал-Жел(80/20)-ТКФ) существенно не изменяло характер и сроки репаративного остеогенеза в зоне костного дефекта. Из особенностей можно отметить, что все регенеративные процессы, а именно энхон-дральный остеогенез, васкуляризация надкостницы, формирование костных балок в зоне материнского ложа и скопление остеокластов на границе с надкостницей, были заметно активнее (рис. 4Г-Е). При использовании в качестве имплантатов 30-конструкций состава Ал и ОКФ процессы репаративного остеогенеза были сходными, но еще более интенсивными: уже через 3 нед. в зоне дефекта была сформирована гипертрофированная многоклеточная волокнистая надкостница, область имплантации была заполнена волокнистой соединительной тканью, а на границе с костным опилом (край дефекта) визуализировались трабекулы формирующейся костной ткани (рис. 5А). Рис. 5. Регенерат в зоне имплантации конструкций из Ал-ОКФ (А, Б, В) и Ал-Жел-ОКФ (Г, Д, Е) в дефект большеберцовой кости крысы: А, Г - 3 нед., Б, Д - 6 нед., В, Е -12 нед. после операции. Окр.: гематоксилин и эозин. Ув. х100 В последующие сроки наблюдения продолжалось формирование костного регенерата в сочетании с активной биорезорбцией гранул ОКФ и вовлечением в этот процесс остеокластов (рис. 5Б). Основным механизмом формирования костной ткани являлся энхондральный, что характерно для длинных трубчатых костей (рис. 5В). Наиболее активно репаративный остеогенез протекал в группе животных с имплантацией трёхкомпонентного композита (Ал-Жел-ОКФ). Так, через 3 нед. наблюдения часть биорезорбированной полимерной составляющей (Ал и Жел) постепенно замещалась новообразованной волокнистой соединительной тканью. Гранулы ОКФ также начинали подвергаться биодеградации, на что косвенно указывало наличие многоядерных клеток инородных тел (остеокластов), число которых постепенно нарастало (рис. 5Г- Е). К концу наблюдения (12 нед.) в зоне дефекта нарастало количество крупных и мелких костных балок (как в толще, так и по периферии имплантата), формировались очаги гемопоэза; остеогенез шел, главным образом, по энхондральному механизму в интермедиарной и периостальной зонах. заключение Костный межклеточный матрикс является уникальным «композитом», включающим минеральную и органическую составляющие. В этой связи, изготовление тканеинженерных конструкций для замещения костных дефектов на основе композиционных материалов, содержащих биополимеры и фосфаты кальция, вполне обосновано и способно улучшить их цито- и биосовместимость, а также остеопластические свойства. С другой стороны, использование 30-печати для изготовления таких конструкций позволяет персонализировать имплантаты в соответствии с геометрией дефекта, придавая им заданную пористость и механические свойства. В настоящей работе были исследованы биосовместимость и остеозамещающие потенции 2- или 3-компонентных прототипов имплантатов, полученных методом 3D печати. Двухкомпонентные композиты содержали в качестве органической составляющей полисахарид Ал, а в качестве минеральной - ТКФ или ОКФ. В состав трехкомпонентных композитов дополнительно входил белок Жел, добавление которого способствовало повышению механической прочности и увеличению пористости изделий. В модели подкожной имплантации мышам было показано, что все исследованные материалы являются биосовместимыми. Наибольшей биоактивностью по скорости биодеградации кальцийфосфатного компонента и замещения образца правильно организованной соединительной тканью, обладали 3О-конструкции, содержащие ОКФ. При имплантации изделий в дефект бедренной кости крыс установлено, что наиболее активно остеогенез протекал в дефектах, замещенных 3-х компонентными имплантатами состава Ал-Жел-ОКФ. На гистологическом уровне это подтверждалось более ранним началом формирования трабекул костного регенерата в зоне дефекта, большим объемом новообразованной костной ткани в одни и те же сроки наблюдения, большим количеством остеокластов в зоне дефекта, более ранней консолидацией имплантата с краями костного дефекта. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о целесообразности и перспективности использования трехкомпонентных минерал-полимер-ных композитов на основе Ал, Жел и ОКФ в качестве остеопластических материалов при 30-печати конструкций, предназначенных для замещения костных дефектов. Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки (Соглашение № 14.604.21.0132 от 21 октября 2014 г. ID: RFMEFI60414X0132).

About the authors

P. A Karalkin

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

N. S Sergeeva

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

V. S Komlev

A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS

Moscow, Russia

I. K Sviridova

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

V. A Kirsanova

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

S. A Akhmedova

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

Ya. D Shanskiy

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

E. A Kuvshinova

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

M. M Filyushin

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

Yu. A Fedotov

A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS

Moscow, Russia

A. Yu Teterina

A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS

Moscow, Russia

Yu. V Zobkov

A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS

Moscow, Russia

S. M Barinov

A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS

Moscow, Russia

A. D Kaprin

P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology

Moscow, Russia

References

Supplementary files