Экспрессия рецептора СD117 в половых железах мужчин при черепно-мозговой травме

Полный текст

Бведение Рецептор CD117 и его лиганд, фактор стволовых клеток (SCF), представляет собой один из ключевых регуляторов пролиферации, дифференцировки и функции различных клеток. CD117+-клетки были изучены в желудочно-кишечном тракте [1], в органах мочевой системы [2]. У человека они описаны в почечной лоханке, мочеточнике, мочевом пузыре, уретре [3-6]. Экспрессия CD117 была обнаружена в различных нормальных тканях и органах плода и взрослых, таких как мозг, надпочечник, кожа, молочная железа и костный мозг, а также, в некоторых злокачественных новообразованиях человека, таких как опухоли гемопоэтической ткани, рак легких, глиобластома головного мозга, семинома [7]. Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 71 Во многих работах показано, что клетки, экспрессирующие CD117, присутствуют в мужских половых железах как в период эмбрионального развития, так и постна-тального и участвуют в трансдукции внеклеточных сигналов, которые контролируют пролиферацию и дифферен-цировку сперматогенных клеток [8]. CD117+-клетки были также обнаружены в интерсти-ции половых желез у больных карциномой предстательной железы [9]. интерес представляет особенность распределения CD117+-клеток в половых железах у больных с гипосперматогенезом, синдромом тестикулярной атрофии и синдромом «Только клетки сертоли» [10]. Однако, исследование CD117+-клетки в половых железах у больных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ) не проводилось. в связи с вышеизложенными данными, целью работы является изучение экспрессии СD117 в тканях мужских половых желез в отсроченном периоде после получения ЧМТ. Материал и методы работа проведена с учетом положений Хельсинской декларации - этические принципы медицинских исследований, объектом которых является человек [11]. Были исследованы ткани половых желез 5 умерших через 15-35 сут. после ЧМТ в возрасте 25-44 лет. Контрольная группа-ткани половых желез 6 мужчин того же возраста, погибших от ЧМТ на месте происшествия. Отбор материала проводился с учетом следующих критериев: 1 ) возрастной интервал 25-60 лет, когда морфологическая структура половых желез и процессы сперматогенеза в нормальных условиях характеризуются определенной стабильностью; 2) минимальные (<6,25 %) атеросклеротические изменения в брюшном отделе аорты (для исключения возможных влияний морфологических изменений половых желез, вызванных атеросклеротическим процессом); 3) отсутствие эндокринных нарушений (анализ клинических данных, указанных в истории болезни); 4) отсутствие морфологических проявлений каких-либо эндокринологических заболеваний: макроскопический (локализация, цвет, масса, внешний вид органа на разрезе) и микроскопический (гистоструктура органов при окраске гистологического среза гематоксилином и эозином) анализ секционного материала органов эндокринной системы; 5) отсутствие повреждения гипоталамуса и гипофиза (констатация закрытой ЧМТ травмы по результатам секционного исследования). Половые железы, извлеченные из окружающих тканей через 5-6 ч., но не позднее 10 ч. с момента констатации смерти освобождались от влагалищных оболочек, придатка и подвергались раздельному взвешиванию и определению объема. Оценка морфологического состояния эпителио-сперматогенного слоя проводилась визуально на площади гистологического среза, окрашенного гематоксилином и эозином, путем подсчета доли измененных канальцев, по отношению ко всем канальцам в 7 случайных полях зрения. в качестве морфометрического показателя состояния сперматогенеза также измеряли площадь поперечного сечения канальцев (мкм2) в полуавтоматическом режиме путем окон-туривания полученных при помощи фотоаппарата изображений на микроскопе «AxioImager» (Zeiss, Германия). в каждом случае проводили измерение 30 поперечных срезов канальцев. Площадь поперечного сечения вычисляли с использованием системы анализа изображения «AxioVision 4.7» (Zeiss, Германия). Гистологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследования проведены в соответствии с рекомендациями С.В Петрова и Н.Т. Райхлина (2012) [7]. Материал фиксировали в течение 24 ч. в 10 % растворе нейтрального формалина (pH 7,0±0,2). Фрагменты тканей после обезвоживания в гистопроцессоре карусельного типа STP120 (ThermoScientific Microm, США) заливали в парафин в модульной системе заливки TES-99 (Medite, Германия). Гистологические срезы толщиной 3-4 мкм изготавливали на ротационном микротоме HM340E (Microm, США), окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для окрашивания срезов HMS 70 (ThermoScientific Microm, США). Для ИГХ-исследования были использованы коммерческие поликлональные кроличьи антитела к CD117 (c-kit) фирмы Dako (Дания). Гистологические срезы наносили на высокоадгезивные стекла (ThermoScientific, США), высушивали в течение 2 ч. при температуре 58 0С, затем 18 ч. при температуре 37 0С. Антигенную активность восстанавливали на водяной бане WB-4MS (BioSan, Латвия) в растворе Target Retrieval Solution pH 9 (Dako, Дания). Дальнейшие операции с препаратами проводили во влажной камере Slide Master (BioOptica, Италия). Инактивацию эндогенной пероксидазной активности осуществляли с помощью инкубирования с блокирующим раствором (Dako, Дания) в течение 15 мин. Далее проводили инкубацию с первичными антителами при температуре 4-8 0С в течение 18 ч., затем инкубацию с вторичными антителами в системе детекции REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse (Dako, Дания) в течение 30 мин. при комнатной температуре, с последующей двукратной инкубацией с диаминбензидином в хромогенном растворе (Dako, Дания) в течение 3 мин. при комнатной температуре. После каждого этапа обработки антителами срезы промывали в фосфатном солевом буфере (Cell Marque, США). На последнем этапе препараты докрашивали гематоксилином Майера (Dako, Дания) и заключали в синтетическую смолу (Shandon-Mount, Thermo Fisher Scientific, США). Также проведены реакции в положительных и отрицательных контролях. Гистологические и ИГХ-срезы анализировали на микроскопе AxioImager Z1 (Zeiss, Германия), фотосъемку осуществляли камерой AxioCam (Zeiss, Германия) с последующей обработкой изображений в программе AxoVision, version 4.7 (Zeiss, Германия). Статистическая обработка материала проводилась с помощью пакета программ Microsoft office. Результаты Анализ гистологической структуры половых желез в контрольной группе лиц, погибших от ЧМТ на месте происшествия, не выявил каких-либо патологических изменений. Средняя площадь поперечного сечения извитых семенных канальцев составляла 35,2х 103±3,7 мкм2. Все 6 типичных клеточных ассоциаций, согласно классификации Y. Clermont [12] прослеживались в большинстве исследованных канальцев. Прослойки интерстициальной соединительной ткани были тонкие, нежные. Интерстициальные эндокриноциты - клетки Лейдига в количестве 3-4 клеток на поперечный срез канальца, имели типичное строение. При исследовании экспрессии CD117-положительно окрашенные клетки в половых железах мужчин, погибших в результате ЧМТ на месте происшествия, обнаруживались как в эпителио-сперматогенном слое извитых семенных канальцев, в их стенке, так и в интерстиции. В эпи-телио-сперматогенном слое среди сперматогоний были выявлены группы клеток с положительным мембранным окрашиванием. Окрашивание отмечалось в сперматого-ниях А-темного типа и А-бледного типа (рис. 1). Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 72 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 1. Эпителио-сперматогенный слой в извитых семенных канальцах мужчины 22 лет: контрольная группа. иммуногистохимическая реакция с антителами к CD 117, докраска: гематоксилин. Ув. х400 Рис. 2. распределение CD 117-положительных клеток в глубоких слоях стенки извитых семенных канальцев мужчины 29 лет: контрольная группа. иммуногистохимическая реакция с антителами к CD 117, докраска: гематоксилин. Ув. х400 Рис. 3. Контакт ГО117+-клеток со стенкой венулы в интерстиции половых желез мужчины 25 лет: контрольная группа, докраска: гематоксилин. Ув. х400 Рис. 4. Кахале подобные клетки в очаге гиперплазии интерстициальных эндокриноцитов в половых желез мужчины 39 лет: контрольная группа, докраска: гематоксилин. иммуногистохимическая реакция с антителами к CD117. Ув. х400 в стенке семенных канальцев CD117+-клетки имели вытянутую, отростчатую, иногда округлую или овальную форму с различной степенью выраженности окрашивания. расположение этих перитубулярных 0D117+-клеток было различным по отношению к наружным и внутренним слоям стенки канальца. в одних полях зрения обнаруживалось простое прилегание CD117+-клеток к наружным слоям стенки канальца, в других-они располагались в стенке канальца между миоидными элементами и их отростками, а также пучками коллагеновых волокон (рис. 2), и в некоторых случаях - вблизи базальной мембраны канальца или даже в тесном контакте с этой мембраной. в межканаль-цевой интерстициальной соединительной ткани CD117+-клетки были распределены равномерно. Отмечались контакты 0D117+-клеток со стенками кровеносных сосудов микроциркуляторного русла: артериолами, капиллярами, венулами (рис. 3). в отдельных полях зрения были видны CD117+-клетки в контакте с нервными волокнами, интерстициальными эндокриноцитами (рис. 4). Анализ гистологических срезов в группе летальных случаев в отдаленные сроки после ЧМТ показал, что количество канальцев с дифференцированными клеточными ассоциациями, согласно классификации Y. Clermont [12], составило в среднем лишь 41,4±5,7 % от всех поперечных срезов канальцев на плоскости гистологического среза. Канальцы, не содержащие сперматид, но имеющие в своем составе сперматоциты и сперматогонии рассматриваются как неполные (недифференцированные) клеточные ассоциации. Среднее количество канальцев с недифференцированными клеточными ассоциациями равнялось 31,4±5,8 % от всех канальцев на плоскости среза. Средняя площадь поперечного сечения канальцев составила 31,8х103±4,2 мкм2, статистически достоверно (p<0,05, t-2,1) уменьшена на 11 %, по сравнению с контрольной группой. В извитых семенных канальцах половых железах определялось очаговое уменьшение количества сперматогенных клеток (рис. 5). В некоторых канальцах обнаруживалось полное отсутствие всех типов сперматоген-ных клеток за исключением сперматогоний. На поперечном срезе в других канальцах определялись сегментарные зоны «выпадения» сперматогенных клеток, которые равнялись 1/4 площади поперечного сечения. Встречались канальцы, в которых указанные зоны составляли до 1/2 площади поперечного сечения. Обнаруживались также канальцы, в которых отсутствие сперматогенных клеток достигало 3/4 площади поперечного сечения Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73 рис. 5. Структура половых желез мужчины 44 лет, погибшего в отдаленные сроки после ЧМТ: «пестрая атрофия половых желез». Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. х200 рис. 6. Выраженная мембранная экспрессия CD117 в большинстве сперматогоний. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD117, докраска: гематоксилин. Ув. х400 : J рис. 7. Кахале-подобные клетки в стенке семенного канальца: синдром «только клетки Сертоли». Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD117, докраска: гематоксилин. Ув. х900 рис. 8. Очаговое увеличение Кахале-подобных клеток в межканальцевой соединительной ткани. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD117, докраска: гематоксилин. Ув. х400 и более. Наряду с этим определялись отдельные канальцы или даже группы канальцев, в которых были сохранены только сустентоциты, что свидетельствовало об очаговом синдроме «Только клетки Сертоли» [5]. Среднее количество подобных канальцев составляло 24,2±5,2 % от всех канальцев на плоскости среза. Все это внешне придавало гистологической картине полиморфный вид, что и послужило поводом для некоторых исследователей называть такую картину «пестрой атрофией половых желез» (рис. 5). Интерстициальные эндокриноциты по периферии канальцев с дифференцированными клеточными ассоциациями так же, как и в контрольной группе были немногочисленны. В то время как по периферии зон канальцев с неполными клеточными ассоциациями, их количество было увеличено до 6-8 клеток на поперечный срез, а в отдельных полях зрения они были значительно гиперплазированы и формировали компактные клеточные скопления. Мембранная экспрессия CD117 в эпителио-сперма-тогенном слое канальцев с недифференцированными клеточными ассоциациями была выражена интенсивно в сперматогониях А-темного типа, А-бледного типа, а также в сперматогониях, изолированно расположенных, имеющих удлиненные ядра (рис. 6). В подобных канальцах CD117+-сперматогонии располагались непрерывной цепочкой. Практически лишь единичные сперма-тогонии не имели положительного окрашивания. Среди резко уменьшенного числа сперматогенных клеток более поздних этапов дифференцировки определялись первичные сперматоциты, преимущественно на стадии пахитены, сперматиды отсутствовали. Крупные вакуоли в эпителио-сперматогенном слое указывали на места расположения погибших сперматоцитов. В половых железах как в группе погибших в отдаленные сроки после черепно-мозговой травмы, так и в контрольной группе, не было обнаружено положительной реакции с CD1 1 7 в сустентоцитах, а также в других типах спер-матогенных клеток: сперматоцитах I, II порядка, ранних и поздних сперматидах. Вместе с этим, в утолщенных и деформированных стенках извитых семенных канальцев определялись Кахале-подобные клетки CD117+ даже в случаях с полной герминальной аплазией и синдромом «только клетки Сертоли» (рис. 7). В интерстиции половых желез в отдаленные сроки после ЧМТ отмечалась гиперплазия интерстициальных эндокриноцитов, а также гиперплазия CD117+-клеток, имеющая очаговый характер (рис. 8). Как правило, очаги гиперплазии обнаруживались Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 74 ОРИГИНАЛьНыЕ ИССЛЕДОВАНИЯ вблизи канальцев с выраженными атрофическими изменениями эпителио-сперматогенного слоя. Обсуждение Изменения, обнаруженные нами в мужской половой железе при ЧМТ, представляют определенный интерес. С одной стороны, значительная частота повреждений головы и высокая смертность при ЧМТ, в сочетании с поражением наиболее трудоспособной категории населения, придают большую социально-медицинскую значимость проблеме черепно-мозгового травматизма. С другой стороны, актуальность изучения изменений, происходящих в гипота-ламо-гипофизарной системе и, особенно, в органах эндокринной системы (в том числе и в половых железах) при черепно-мозговой травме обусловлена важностью этой системы в поддержании гомеостаза организма [13]. И, наконец, у целого ряда больных, перенесших ЧМТ, развиваются нарушения сексуальной и репродуктивной функций, в основе которых лежит морфофункциональная недостаточность, весьма характерная для вторичного гипогонадизма [14]. Проведенные ранее морфологические исследования тканей мужских половых желез при внезапной сердечной смерти [15], атеросклерозе [16] и наркомании [17] позволили выявить стереотипность изменений эпителио-спер-матогенного слоя и эндокринного аппарата половых желез, что давало возможность предположить аналогичный характер изменений при ЧМТ. Однако морфологические изменения мужских половых желез при ЧМТ, в том числе изменения иммунногистохимических характеристик, до настоящего времени остаются практически неизученными. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в половых железах больных, перенесших черепно-мозговую травму, в отдаленные сроки наблюдается уменьшение площади поперечного сечения канальцев на 11 %, дезорганизация эпителио-сперматогенного слоя, заключающаяся в уменьшении частоты встречаемости типичных клеточных ассоциаций, и очаговое «выпадения» спер-матогенных клеток. Все это, в целом, ведет к развитию очагового морфологического синдрома «только клетки Сертоли» Изменения интерстициальных эндокриноцитов имеют характер очаговой гиперплазии. Распределение CD117+-клеток в паренхиме мужских половых желез было наиболее детально изучено в условиях обструктивной и необструктивной азооспермии, а также при тестикулярной атрофии и синдроме «Только клетки Сертоли» [10]. В связи с этим, полученные нами данные о том, что в отдаленные сроки после ЧМТ обнаруживаются выраженные деструктивные изменения эпителио-сперматогенного слоя, приобретающие впоследствии характер полной герминальной аплазии (синдром «только клетки Сертоли»), имеют, несомненно, не только научный интерес, но и практическую значимость. Как было установлено нами ранее, индуцированная ЧМТ деструкция сперматогенных клеток ведет к активизации пролиферативных процессов в сохранившихся сперматогониях эпителио-сперматогенного слоя. [18]. Следовательно, особую важность имеют полученные данные об усилении мембранной экспрессии CD117 в спер-матогониях различных типов (А-темного типа, А-бледного типа, а также в сперматогониях, изолированно расположенных, имеющих удлиненные ядра). Хорошо известен факт усиления пролиферативной активности и дифференциров-ки гемопоэтических клеток, меланоцитов и клеток Кахаля желудочно-кишечного тракта под влиянием CD117 [19]. В отдаленные сроки после ЧМТ, по-видимому, под воздействием CD117 также происходит усиление пролифератив-ной активности и дифференцировки сперматогоний. Таким образом, возможно, реализуется постатрофическая регенерация популяции сперматогенных клеток после их повреждения. СD117+-клетки, расположенные в различных слоях стенки канальцев, взаимодействуя с гладкомышечными клетками стенки канальцев, вероятно, обеспечивают не только перемещение сперматогенных клеток из базального отдела эпителио-сперматогенного слоя в адлюминаль-ный, но и играют важную роль в сокращении стенки канальца и перемещении сперматогенных клеток в продольном направлении: от периферии к области сети средостения половой железы - т. н. «волну сперматогенеза» [20]. Особый интерес представляет контакт интерстициальных эндо-криноцитов половых желез с Кахале-подобными клетками стромы. Он, несомненно, указывает на тесную морфофункциональную взаимосвязь между этими клетками.

Об авторах

А. В Федотов

Бюро судебно-медицинской экспертизы

Рязань, Россия

А. Ф Астраханцев

Центральная клиническая больница № 2 им. Н.А. Семашко ОАО «РЖД»

Email: afastra@mail.ru

М. П Мазурова

Центральная клиническая больница № 2 им. Н.А. Семашко ОАО «РЖД»

Список литературы

Дополнительные файлы