Long QT syndrome: genetic analysis of patients

Full Text

Введение Синдром удлиненного интервала QT (LQTS) - заболевание, характеризующееся увеличением продолжительности интервала QT на электрокардиограмме, синкопе, желудочковой тахикардией типа «пируэт» (torsades de pointes) и высоким риском внезапной сердечной смерти. Удлиненным считается корригированный (рассчитываемый с учетом частоты сердечных сокращений) интервал QT (QTc) продолжительностью более 440 мсек. Однако клиническое значение имеет QTc продолжительностью более 450 мсек для мужчин и 460 мсек для женщин [1]. Увеличение продолжительности интервала QT происходит из-за более длительной реполяризации кардиомиоцитов, которая может привести к возникновению приступа желудочковой тахикардии типа «пируэт» [2]. Желудочковая тахикардия вызывает синкопе, а при долгой продолжительности приступа - фибрилляцию желудочков, которая, в свою очередь, может стать причиной внезапной смерти больного [1]. Частота встречаемости данного заболевания составляет до 1:2000 [3]. Лечение LQTS начинается с приема пациентами ß-блокаторов. В зависимости от степени тяжести синдрома и эффективности ß-блокаторов может быть выполнена левосторонняя симпатическая денервация сердца, имплантация кардиовертера-дефибриллятора или кардиостимулятора (при наличии синусовой брадикардии) [1]. Увеличение QTc обусловлено широким спектром причин, которые включают различные сердечно-сосудистые заболевания, электролитный дисбаланс, прием некоторых лекарств [2, 4], а также наличие мутаций в генах, кодирующих белки, ответственные за структуру и функционирование ионных каналов кардиомиоцитов. В большинстве случаев врожденный LQTS является заболеванием с аутосомно-доминантным типом наследования. В настоящее время описано более 700 мутаций в 15 генах: KCNQ1, KCNH2, SCN5A, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CACNA1C, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1, KCNJ5, CALM1, CALM2. По числу 76 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ генов, в которых встречаются вызывающие LQTS мутации, выделяют 15 типов врожденного синдрома [2, 5]. Мутации нарушают функционирование калиевых, натриевых или кальциевых каналов, определяющих потенциал действия кардиомиоцита. В результате типы врожденного LQTS различаются факторами, индуцирующими желудочковую тахикардию, чувствительностью к лечению ß-блокаторами и, соответственно, подходами, применяемыми для их терапии [6-8]. Более 75 % вызывающих LQTS мутаций приходятся на гены KCNQ1 и KCNH2, которые кодируют а-субъединицы каналов медленного и быстрого компонентов калиевого тока задержанного выпрямления [2, 9]. Мутации в различных районах одного и того же гена по-разному сказываются на свойствах кодируемого им белка, что влияет на степень проявления LQTS у пациентов: от значительного увеличения интервала QT и раннего начала аритмических событий и синкопе до практически нормального интервала QT и отсутствия симптомов синдрома [10, 11]. Такая гетерогенность в проявлении заболевания может быть характерна даже для носителей одинаковой мутации в пределах одной семьи [12-14]. Таким образом, врожденный LQTS имеет довольно сложную генетическую природу. Проведение генетического анализа пациентов с LQTS позволяет ставить более точный диагноз (определять тип синдрома) и выбирать наиболее эффективные методы терапии. Учитывая тот факт, что врожденный LQTS является семейным заболеванием, генетический анализ также дает возможность своевременно выявлять носителей мутаций с повышенным риском развития LQTS среди родственников пациента. Настоящая работа направлена на изучение генетической природы LQTS. Представлены результаты генетического анализа 16 пациентов с LQTS или подозрением на синдром, а также семейного анализа носителей двух вызывающих LQTS мутаций в гене KCNQ1 и одного ассоциированного с LQTS полиморфизма в гене KCNE1. Материал и методы Для проведения генетического анализа была использована геномная ДНК пациентов с LQTS или подозрением на него (n=16), обратившихся в Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина, после получения информированного согласия. Геномную ДНК выделяли из образцов крови пациентов с помощью QIAamp Blood Maxi Kit (QIAGEN, Германия). Поиск мутаций проводили путем секвениро-вания ПЦР-продуктов, содержащих экзоны генов KCNQ1 и KCNH2. Секвенирование ПЦР-продуктов осуществлялось в ЦКП «Геномика» СО РАН. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с нуклеотидными последовательностями экзонов генов KCNQ1 и KCNH2 из базы данных NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/, NM_000218.2 и NM_000238.3) с применением программы CodonCode Aligner. Для некоторых пациентов было выполнено секве-нирование экзонов 13 генов, мутации в которых ассоциированы с LQTS: KCNQ1, KCNH2, SCN5A, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CACNA1C, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1, KCNJ5. Секвенирование проводила компания «Геноаналитика» с использованием системы отбора районов SureSelect (Agilent, США) и секве-натора GaIIx (Illumina, США). Анализ полученных ридов осуществляли программой Geneious7. Наличие мутаций и(или) однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs) подтверждалось сек-венированием по Сэнгеру. Результаты Результаты генетического анализа пациентов с синдромом удлиненного интервала QT или подозрением на него представлены в табл. У 3 из 16 пациентов были выявлены замены в одном из аллелей гена KCNQ1: p.Ala178Pro (c.532G>C, пациент 12), p.Val254Met (c.760G>A, пациент 2) и p. Gly325Arg (c.973G>A, пациент 3) (табл.). Замены p.Ala178Pro, p.Val254Met и p.Gly325Arg в гене KCNQ1 являются патогенными мутациями и вызывают врожденный LQTS 1 типа [10, 11, 15-22]. На наличие мутаций p.Ala178Pro и p.Val254Met в гене KCNQ1 были проверены 4 родственника пациента 12 и 7 родственников пациента 2 (рис. 1А, Б). Было установлено, что в обоих случаях мутации были унаследованы пациентами от матери, а также среди членов семьи выявлялись и другие носители этих мутаций. Однако все носители мутаций p.Ala178Pro и p.Val254Met в гене KCNQ1, обнаруженные при семейном анализе, являлись асим-птомными и до настоящего времени не демонстрировали каких-либо проявлений синдрома. У 7 пациентов были обнаружены замены в одном из аллелей гена KCNH2: p.Gly604Ala (c.1810G>C, пациент 10), p.Thr613Met (c.1838C>T, пациент 11), p.Lys897Thr (c.2690A>C, пациенты 7, 8, 10, 11, 15, 16), p.Arg1047Leu (c.3140G>T, пациент 13) (табл.). Роль замены p.Gly604Ala в развитии LQTS в настоящее время не установлена, в то время как замена p.Thr613Met является патогенной мутацией и вызывает врожденный LQTS 2 типа [19, 21-24]. Помимо мутаций p.Gly604Ala и p.Thr613Met, у пациентов 10 и 11 в гене KcNh2 был найден полиморфизм p.Lys897Thr. Он был также выявлен у пациентов 7, 8, 15, 16. В литературе встречаются противоречивые данные о влиянии этого SNP на увеличение длительности реполяризации кардиомиоцитов и интервала QT [25-29]. В настоящее время этот полиморфизм считается нейтральным (benign/likely benign согласно базе данных ClinVar (NCBI)) и, по-видимому, не играет роли в развитии LQTS. У пациента 13 был обнаружен полиморфизм p.Arg1047Leu. По некоторым данным он может способствовать развитию желудочковой тахикардии типа «пируэт» [30, 31]. Тем не менее его клиническое значение пока не ясно (benign/likely benign/uncertain significance). При секвенировании экзонов генов KCnQi и KCNH2 у пациентов 4, 8 и 14 не было обнаружено мутаций, вызывающих LQTS. Однако известно, что среди родственников этих пациентов есть случаи проявления симптомов LQTS и даже два случая внезапной смерти (пациент 8). Это может свидетельствовать о наличии мутации, вызывающей синдром, в других генах. Для этих пациентов было проведено секвенирова-ние экзонов 13 генов (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CACNA1C, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1, KCNJ5), мутации в которых могут вызывать LQTS (табл.). У пациента 4 был найден полиморфизм p.Asp85Asn (c.253G>A) в гене KCNE1, который кодирует ß-субъединицу каналов медленного компонента калиевого тока задержанного выпрямления. Данные по клиническому значению этого SNP противоречивы (benign/likely benign/likely pathogenic/pathogenic/ uncertain significance). Столь неоднозначный результат может объясняться тем, что, как было показано в одном исследовании, полиморфизм p.Asp85Asn является фактором риска и способен приводить к развитию LQTS сам по себе, в сочетании с мутациями, а также на фоне приема некоторых лекарств, нарушений электролитного баланса и других сердечно-сосудистых заболеваний [32]. Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ 77 ДЛлЛдА т С С G С С G С АамЛлЛ Т С С G С С G ЛЛлАМА Т С С G Т G G ЛЛдАлЛ Т С С G С С G С ЛллАаА Т С С G С С G ААДМД ЛлАлМЛ Т С CGTGG TCCGTGG А А ■ АллАЛМ Т С С G Т G G JMÜaA ЛЛ/UmA ллАааЛл АлЛАм Лллллм с Т CCGTGG TCCGTGG TCCGTGG TCCGTGG В АлАлЛм ДллД/\АЛ Т С С G А т G ТС С G A TG А ЛаДаАла ЛлЛаЛлл TCCGATG TCCGATG А А іаАЛлЛ TCCGATG Рис. 1. Семейный анализ несинонимичных замен в генах KCNQ1 и KCNE1. А - вызывающая LQTS мутация p.Ala178Pro в гене KCNQ1; Б - вызывающая LQTS мутация p.Val254Met в гене KCNQ1; В - ассоциированный с LQTS полиморфизм p.Asp85Asn в гене KCNE1. Для каждого родственника представлен фрагмент профиля секвенирования соответствующих экзонов генов KCNQ1 и KCNE1. Стрелкой указана позиция, где в одном из аллелей наблюдаются исследуемые замены. «?» - образец крови данного члена семьи не был предоставлен для анализа Генетический анализ 4 родственников пациента 4 показал наличие этого SNP у матери пациента и его сестры с удлиненным интервалом QT (рис. 1В). Однако у дочери пациента 4 (пациент 5), также страдающей LQTS, sNp не был обнаружен. Секвенирование экзонов 13 генов, ассоциированных с LQTS, у пациента 5 не выявило общих с пациентом 4 мутаций и(или) SNPs, которые могли бы стать причиной LQTS в этой семье. Более того, не было найдено также специфических мутаций и(или) SNPs, которые могли бы вызвать LQTS у пациента 5. В результате секвенирования экзонов 13 генов у пациента 8 в дополнение к полиморфизму p.Lys897Thr в гене KCNH2 были найдены еще два SNPs: p.His558Arg (c.1673A>G) в гене SCN5A, кодирующем а-субъединицу канала натриевого тока, и p.Val2369Ala (c.7106T>C) в гене ANK2, кодирующем анкирин B. У пациента 14 был выявлен полиморфизм p.Pro2835Ser (c.8503C>T) в гене ANK2 (табл.). Некоторые исследования показали, что наличие этих SNPs увеличивает вероятность аритмических событий [30, 33]. Однако на данный момент все 3 SNPs считаются нейтральными (benign/likely benign) и, скорее всего, не приводят к развитию LQTS. Обсуждение Секвенирование экзонов генов KCNQ1 и KCNH2, в которых вызывающие LQTS мутации встречаются наиболее часто, позволило подтвердить диагноз LQTS у 3 пациентов. Носители патогенных мутаций p.Val254Met, p.Gly325Arg в гене KCNQ1 и p.T613M в гене KCNH2 в дополнение к значительному удлинению интервала QT (QTc>500 мсек) имели и другие характерные особенности LQTS: синкопе, эпизоды желудочковой тахикардии, родственники с синкопе и внезапной смертью в молодом возрасте (табл., пациенты 2, 3, 11 ). Также патогенная мутация p.Ala1 78Pro в гене KCNQ1 была обнаружена у пациента, который из всех симптомов LQTS имел только удлиненный интервал QT (табл., пациент 12). Наличие патогенной мутации и удлиненный интервал QT предполагают возможность проявления других симптомов LQTS в будущем. В связи с этим необходим регулярный мониторинг состояния пациента, по крайней мере, до возраста 25 лет, поскольку есть данные о том, что у мужчин, являющихся асимптомными носителями мутаций, вызывающих LQTS 1 типа, после достижения этого возраста редко возникают проявления синдрома [1]. У одного из пациентов (табл., пациент 10) в гене KCNH2 была обнаружена несинонимичная замена p.Gly604Ala, роль которой в LQTS не была ранее исследована. Поскольку Gly604 находится вблизи функционально значимого порового домена белка KCNH2, то его замена на другую аминокислоту может быть критичной. В пользу данного предположения говорит тот факт, что в литературе уже была описана патогенная мутация p.Gly604Ser, вызывающая врожденный LQTS 2 типа [19, 22-24, 34]. Однако прежде, чем рассматривать замену p.Gly604Ala в гене KCNH2 в качестве мутации, вызывающей врожденный LQTS, необходимо провести ее функциональные исследования. Остальные 11 пациентов не имели патогенных мутаций в генах KCNQ1 и KCNH2. Из них 4 пациента являлись носителями нейтрального полиморфизма p.Lys897Thr в гене KCNH2 (табл., пациенты 7, 8, 15, 16), а один пациент имел полиморфизм p.Arg1047Leu в гене KCNH2 с неясным клиническим значением (табл., пациент 13). Оставшиеся 6 пациентов не имели полиморфизмов в генах KCNQ1 и KCNH2 (табл., пациенты 1, 4, 5, 6, Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 78 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ Таблица. Результаты генетического анализа пациентов с синдромом удлиненного интервала QT или подозрением на него Пациент Пол Возраст Клиническая картина, анамнез Мутация или SNP Ген Клиническое значение замены* 1 Ж 29 QTc=508 мсек, ЖТ типа «пируэт», синкопе не выявлены - - 2 М 9 QTc=520 мсек, синкопе p.Val254Met KCNQ1 патогенная 3 Ж 37 QTc>500 мсек, синкопе у брата, внезапная смерть матери и брата в молодом возрасте p.Gly325Arg KCNQ1 патогенная 4 Ж 42 QTc>460 мсек, потери сознания p.Asp85Asn KCNE1 данные противоречивы, фактор риска 5 Ж 19 Предобморочные состояния и синкопе, удлиненный интервал QT у мамы и тети не выявлены - - 6 Ж 47 QTc=540 мсек, пароксизмальная полиморфная ЖТ, частая желудочковая экстрасистолия, пароксизмальное трепетание-фибрилляция желудочков, многократные реанимационные мероприятия по поводу клинической смерти не выявлены 7 Ж 48 QTc=480-540 мсек, пароксизмальная ЖТ, синкопе p.Lys897Thr KCNH2 нейтральная 8 Ж 13 Удлинение QTc до 460 мсек, 2 внезапные смерти по отцовской линии p.Lys897Thr p.His558Arg p.Val2369Ala KCNH2 SCN5A ANK2 нейтральные 9 Ж 34 Пароксизмальная ЖТ с приступами МЭС не выявлены - - 10 Ж 28 QTc=400 мсек (на фоне терапии), потери сознания, удлинение QTa пароксизмы ЖТ с переходом в фибрилляцию желудочков, эпизод остановки кровообращения p.Gly604Ala p.Lys897Thr KCNH2 нет данных нейтральная 11 Ж 31 QTc=540 мсек, частые синкопе, пароксизмы ЖТ, включая веретенообразную ЖТ p.Thr613Met p.Lys897Thr KCNH2 патогенная нейтральная 12 М 6 QTc=500 мсек, других симптомов LQTS нет p.Ala178Pro KCNQ1 патогенная 13 Ж 57 QTc=480-520 мсек, потери сознания, частая полиморфная желудочковая экстрасистолия с пробежками ЖТ, эпизоды фибрилляции желудочков p.Arg1047Leu KCNH2 данные противоречивы 14 М 25 QTc был 500 мсек (сейчас в норме), пароксизмы ЖТ, болеет отец и сводный брат по отцу, диагноз LQTS под вопросом p.Pro2835Ser ANK2 нейтральная 15 Ж 30 QTc=420 мсек, синкопе, фибрилляция желудочков, ВПС, множественные мышечные дефекты межжелудочковой перегородки, синдром слабости синусового узла, синусовая брадикардия, недостаточность кровообращения I ст., функциональный класс I NYHA p.Lys897Thr KCNH2 нейтральная 16 Ж 15 Q^ до 500 мсек, других проявлений LQTS нет, семейный анамнез не отягощен p.Lys897Thr KCNH2 нейтральная * Клиническое значение выявленных замен указано согласно критериям ACMG2015 и взято из базы данных ClinVar (NCBI). ЖТ - желудочковая тахикардия; ВПС - врожденный порок сердца; приступы МЭС - приступы Морганьи-Эдемса-Стокса. Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ 79 9, 14). Пациенты демонстрировали существенные различия в степени проявления LQTS: умеренное увеличение QTc (до 500 мсек) и отсутствие синкопе; QTc>500 мсек, синкопе и приступы желудочковой тахикардии; наличие эпизодов фибрилляции желудочков и даже клинической смерти. Отсутствие при секвенировании экзонов генов KCNQ1 и KCNH2 мутаций, вызывающих LQTS, значительно снижает вероятность врожденного LQTS у данных пациентов, но не исключает возможности наличия мутаций в других генах, ассоциированных с данным синдромом. Поэтому для проверки диагноза LQTS или определения его формы (врожденная или приобретенная) может быть целесообразным проведение генетического анализа пациентов, включающего большее число генов-кандидатов. Секвенирование экзонов 13 ассоциированных с LQTS генов было выполнено для 4 пациентов (4, 5, 8, 14), в семьях которых были родственники с симптомами заболевания или случаи внезапной смерти. Однако только в одном случае был обнаружен ассоциированный с LQTS полиморфизм (пациент 4). Полиморфизм p.Asp85Asn в гене KCNE1 может объяснять проявления синдрома у пациента 4, а также удлинение QTc у его сестры. Дочь пациента 4 (пациент 5), также страдающая LQTS, данный SNP не имела. Она могла бы унаследовать мутацию и(или) SNPs, вызывающие LQTS, от отца, но секвени-рование экзонов 13 генов, ассоциированных с LQTS, их не выявило. Возможно, что у дочери пациента 4 все же существует мутация и(или) SNPs, приводящие к развитию LQTS, в других генах или некодирующих частях генома или синдром является приобретенным и вызван негенетическими причинами. У 2 других пациентов (8 и 14) были найдены лишь нейтральные полиморфизмы в генах SCN5A и ANK2. Этот результат согласуется с небольшим увеличением QTc (до 460 мсек) и отсутствием синкопе у пациента 8 и единичным увеличением QTc до 500 мсек, которое не подтвердилось на серии ЭКГ, у пациента 14. Случаи внезапных смертей по отцовской линии (пациент 8) и семейных проявлений желудочковой тахикардии (пациент 14) могут быть не связаны с LQTS. Поскольку врожденный LQTS является семейным заболеванием, то интерес представлял генетический анализ родственников пациентов-носителей мутаций, вызывающих синдром. Было исследовано 4 родственника пациента 12 (мутация p.Ala178Pro в гене KCNQ1) и 7 родственников пациента 2 (мутация p.Val254Met в гене KCNQ1 ). Генетический анализ обеих семей выявил еще 5 носителей данных мутаций (рис. 1А, Б), но все они являлись асимптомными. Одним из асимптомных носителей был мальчик 10 лет (мутация p.Val254Met). Как и в случае с носителем мутации p.Ala178Pro, он входит в группу риска, и его состояние следует регулярно отслеживать. Остальные 4 асимптомных носителя оказались женщинами в возрасте 31 (мутация p.Val254Met), 32 (мутации p.Ala178Pro и p.Val254Met) и 63 лет (мутация p.Ala1 78Pro). У двух женщин с мутацией p.Ala1 78Pro и одной женщины с мутацией p.Val254Met был измерен QTc, который составил менее 500 мсек. По некоторым оценкам взрослые асимптомные носители мутаций, вызывающих врожденный LQTS 1 типа, с QTc<500 мсек имеют низкий риск развития синдрома [1]. В связи с этим вероятность развития синдрома у 3 асимптомных носительниц мутаций p.Ala178Pro и p.Val254Met можно считать невысокой, хотя они и входят в группу риска. Факт различной степени проявления синдрома у носителей одинаковых мутаций установлен не впервые [12-14]. Однако причины этого феномена до сих пор не ясны. Считается, что различия в степени проявления синдрома могут быть обусловлены как негенетическими причинами [35], так и наличием и(или) отсутствием определенных SNPs [36-38]. Следовательно, данные об асимптомных носителях мутаций p.Ala178Pro и p.Val254Met в гене KCNQ1 в дальнейшем можно использовать для поиска факторов, определяющих степень проявления LQTS.

About the authors

E. V Dementyeva

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the RAS

S. P Medvedev

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the RAS; Novosibirsk State University

E. A Elisaphenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the RAS

S. A Bayramova

E.N. Meshalkin National Medical Research Center

E. A Pokushalov

E.N. Meshalkin National Medical Research Center

K. I Agladze

Moscow Institute of Physics and Technology

S. M Zakian

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the RAS; Novosibirsk State University

References

Supplementary files