Opyt polucheniya ANTICD19-CAR-KLETOK

Abstract

Full Text

Одним из перспективных направлений в лечении В-линейных опухолей является CAR-T-терапия. CAR-T представляет собой Т-лимфоцит, в геном которого внедрен ген CAR (химерного антигенного рецептора). Внеклеточный домен данного рецептора обеспечивает распознавание мишени (например, CD19), а внутриклеточный - активирует CAR-T, что ведет к уничтожению клетки-мишени. В данном исследовании нами были получены CAR-T и исследована их цитотоксичность. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Т-клетки периферической крови здорового донора культивировались на среде OptiMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицин, 300 ЕД/мл рекомбинантного человеческого IL-2 и 2 мкл DynabeadsHumanT-Activator. Через 48 ч. культура подвергалась вирусной трансдукции лентивирусным препаратом, содержащим гены CAR, специфичного к CD19, пептида RIAD для усиления активационного сигнала и pепортерного белка GFP для оценки эффективности трансдукции. РЕЗУЛЬТАТЫ. Жизнеспособность Т-лимфоцитов на 3 день после проведения трансдукции лентиви-русным препаратом достигала 91,87%. Экспрессия репортерного белка GFP в жизнеспособных Т-лимфоцитах составляла 50,87%. При культивировании в среде, содержащей IL-2 без добавления специфического активатора (rCD19), количество CAR-Т через 120 ч. снижается в 1,5 раза относительно их числа через 48 ч. культивирования, в то время как в присутствии rCD19 (2 мкг/мл) количество CAR-T через 120 ч. увеличивается в 1,4 раза относительно 48 ч. Для оценки цитотоксических свойств CAR-T их культивировали совместно с двумя линиями клеткок-мишеней: K562^D19- (контрольная линия без экспрессии CD19) и K562-CD19 + (оверэкспрессоры CD19). Изначальное соотношение Т-лимфоцитов и клеток-мишеней составляло 1:1, по 50%. После 48 часов культивирования CAR-T с клетками K562-CD19- количество СAR-T снижалось до 36,2%. В случае культивирования CAR-T с клетками K562-CD19+ процент CAR-T увеличивается до 57% и 84,5% после 48 и 120 ч. экспозиции соответственно. Жизнеспособность клеток-мишеней через 120 ч. культивирования заметно снижалась в экспериментальной группе, по сравнению с контрольной (3,5% против 36,74%). Жизнеспособность и GFP-позитивность CAR-T в экспериментальной группе составила 78,98% и 45,79% соответственно. ВЫВОДЫ. 1. Лентивирусный вектор эффективно трансду-цировал Т-лимфоциты и практически не влиял на их жизнеспособность при последующем культивировании. 2. Общее количество CAR-T в присутствии rCD19 возрастало по сравнению с контрольной группой. 3. При со-культивировании CAR-T с K562-CD19 + наблюдалась активная элиминация и снижение жизнеспособности CD19 позитивных клеток-мишеней при значительном и устойчивом превалировании CAR-T в смешанной популяции клеток. Получение потенциально клинически применимых CAR-T является первым шагом к развитию технологии адоптивной иммунотерапии в Российской Федерации. В настоящее время нами также реализуется стратегия, направленная на снижение токсичности CAR-терапии и получение аллогенного off-the-shelf препарата.