Autologic platelet-rich plasma use in varicocelectomy

Full Text

Термин «варикоцеле» был впервые предложен T.B. Curling в 1843 г. [1]. Согласно определению O. Ivanissevich (1960), варикоцеле-это анатомо-клинический синдром, а именно патологическое расширение вен гроздевидного сплетения семенного канатика, клиническим проявлением которого является венозный рефлюкс [2]. По данным Европейской Ассоциации Урологов (ЕАУ) от 2018 г., данная патология встречается у 11,7% всех взрослых мужчин и у 25,4% мужчин с отклонениями в спермограмме [3]. Существует взаимосвязь возникновения данного заболевания с возрастом пациентов - варикоцеле очень редко встречается у детей до 10 лет, затрагивает от 7-8% мальчиков 11-14 лет и до 14% подростков 15-19 лет [4], а частота возникновения данной патологии у взрослого населения повышается на 10% с каждым прожитым десятилетием [5]. Варикоцеле может протекать бессимптомно, а может вызывать дискомфорт или острые боли [6]. Наиболее тяжелыми осложнениями считают атрофию яичка, гипогонадизм, эректильную дисфункцию (ЭД) [7] и бесплодие [8, 9]. У 40% нефертильных мужчин причиной бесплодия является варикоцеле [8, 9]. Существует и обратная статистика, согласно которой у каждого пятого больного с варикозным расширением вен одного или обоих яичек, обнаруживают нарушение фертильности [10]. К причинам возникновения нарушения сперматогенеза и, как следствие, снижения фертильности принято относить множество факторов: повышение температуры и давления в мошонке, обусловленное затруднением и замедлением оттока венозной крови от яичка из-за отсутствия клапанов; гипоксию; накопление токсических Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 40 ОБЗОРЫ метаболитов, повреждающих сперматогенный эпителий и клетки Лейдига; нарушение гормональной регуляции, вследствие рефлюкса крови из надпочечниковой вены с повышенным содержанием биологически активных веществ, в том числе тестостерона, в расширенную, по причине стаза, яичковую вену, приводит к снижению продукции тестостерона самими клетками Лейдига по принципу отрицательной обратной связи и замедлению сперматогенеза в яичках; аутоиммунные процессы; апоп-тоз [11-13]. Повреждение в данных клетках и тканях может быть подтверждено обнаружением биомаркеров апоптоза (BAX, BCL2) и биомаркеров оксидативного стресса (ОС) - малондиальдегида (MDA), и глутатионпероксидазы (ГП). Однако это не единственные индикаторы повреждения. Известно, что роль РНК в клетке заключается не только в посредничестве между ДНК и белком. РНК-это мощный регулятор структуры генома и экспрессии генов, а микро-РНК может предоставить информацию об активности экспрессии генов сперматозоидов. В 2016 г. в Египте было проведено исследование M. Taymour с соавт. [14] по количественной оценке отношения уровня микро-РНК к маркерам ОС и апоптоза у бесплодных мужчин с варико-целе. Было обнаружено, что уровень содержания в сперме микро-РНК-122, микро-РНК-181а, микро-РНК-34с5 был достоверно снижен у бесплодных мужчин с варикоцеле и олигоастенотератозооспермией (ОАТ-синдром) по сравнению с группами, в которых не было отмечено снижение фертильности. Также уровень микро-РНК положительно коррелировал с некоторыми параметрами спермограммы (общим количеством сперматозоидов в эякуляте, общей подвижностью сперматозоидов, количеством сперматозоидов с нормальной морфологией) и отрицательно коррелировал с активностью маркеров ОС и апоптоза. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что снижение микро-РНК в сперме, наряду с увеличением маркеров оксидативного стресса и апоптотических маркеров, действительно являются признаками патологии, по которым можно судить о нарушенной функции семенников и снижении фертильности [15]. Генетические факторы, обусловливающие предрасположенность к варикоцеле, до конца не изучены. Полученные результаты первых исследований говорят о том, что определенную роль в развитии варикоцеле играют микроделеции в Y хромосоме, хромосомные аномалии, аномальная экспрессия генов GSTT1, GSTM1, AR, MT1M, PHLDA1, CCIN, PRM2, патологически метилированная ДНК и другие [16]. На сегодняшний день эффективным лечением вари-коцеле является только оперативное вмешательство. Разработано множество протоколов операций, суть которых заключается в эмболизации или перевязке вен семенного канатика, с целью восстановления нормального кровотока яичка. Один из наиболее эффективных способов микрохирургического иссечения вен семенного канатика - операция Мармара. Данная операция характеризуется низким риском развития послеоперационных осложнений (сохранение яичковой артерии - 99-100%, послеоперационное гидроцеле - 0-1%, рецидив варико-целе - 1,9-2,85%), коротким периодом восстановления (2,4±0,69 сут.) [17-19]. После операции Мармара значительно улучшаются показатели спермограмм пациентов: увеличивается количество сперматозоидов в 1 мл эякулята, нормализуется морфология и подвижность, снижается индекс фрагментации ДНК [20, 21]. Один из важных показателей успешности лечения варикоцеле - наступление спонтанной беременности. Ряд авторов отмечают высокие значения этого показателя после проведения микрохирургического иссечения вен семенного канатика [22-24]. Несмотря на то, что операция Мармара - это современный и безопасный метод лечения варикоцеле [2527], остается ряд пациентов, проблему бесплодия которых операция не решает или решает не в полной мере, не приводя к наступлению желанной беременности в паре. Перспективным и многообещающим является решение данной проблемы путем применения клеточных технологий в регенеративной медицине. В качестве субстратов рассматриваются стромально-васкулярная фракция (СВФ, stromal vascular fraction, SVF), стволовые клетки жировой ткани (Adipose-derived stem cells, ADSC), мезенхимальные стволовые клетки (Mesenchymal stem cells, MSCs), сперматогенные стволовые клетки (Spermatogenic stem cells), аутоплазма, обогащенная тромбоцитар-ными факторами роста (АОТ, Рlatelet-rich plasma, PRP). Введенная совсем недавно в медицинскую практику АОТ представляется весьма перспективным направлением. Множество уже проведенных доклинических и клинических исследований показали высокую эффективность данной методики [28, 29] в косметологии [30], офтальмологии [31], спортивной медицине [32], стоматологии [33], тканевой инженерии [34], в реконструкции нервов и нервных стволов [35, 36], лечении сахарного диабета 2 типа [37] и его осложнений [38] и её безопасность [39, 40]. Однако требуется еще больше исследований для подтверждения этих данных в системном анализе [41, 42]. Аутоплазма, обогащенная тромбоцитарными факторами роста - это полученный методом центрифугирования концентрат аутогенных тромбоцитов человека в малом объеме плазмы. Помимо тромбоцитов, АОТ может быть дополнительно обогащена лейкоцитами и(или) фибрином. Учеными из США, Европы и Южной Кореи на основании фибриновой архитектуры и клеточного состава была принята классификация, разделяющая АОТ на 4 семейства: аутоплазма, обогащенная тромбоцитарными факторами роста (Pure Platelet-rich plasma, P-PRP); аутоплазма, обогащенная тромбоцитар-ными факторами роста и лейкоцитами (Leukocyte- and Platelet-rich plasma, L-PRP); аутоплазма, обогащенная тромбоцитарными факторами роста и фибрином (Pure Platelet-rich fibrin, P-PRF); аутоплазма, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, лейкоцитами и фибрином (Leukocyte- and Platelet-rich fibrin, L-PRF) [43]. Действие АОТ обусловлено содержащимися в гранулах тромбоцитов биологически активными веществами - тромбоцитарным фактором роста (platelet-derived growth factor, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), фактором роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF), фактором роста эпидермиса (epidermal growth factor, EGF), фактором роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF), фактором роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF), тромбоцитарным фактором роста (platelet-derived growth factor, PDGF), трансформирующим фактором роста (transforming growth factor, TGF-B1, TGF-B2), инсулиноподобным фактором роста-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1), ламинином-8, тромбо-спондином-1, 2 (thrombospondin, TSP-1, 2), белками гемостаза (фактор фон Виллебранда, фактор V, фактор IX, фибриноген), белками-ингибиторами коагуляции (антитромбин, протеин S, Protein-S), протеазами nexin-1 и 2, ингибиторами пути тканевого фактора (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), хемокинами: CCL-2 (MCP-1), CCL-3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL-7 (MCP-3), CXCL1 (GRO-a), CXCL2 (MIP-2), CXCL4 (PF4), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (LIX), CXCL8 (IL-8), CXCL12 (SDF-1a), белками системы комплемента (предшественник комплемента C3, предшественник комплемента C4, фактор D, фактор H, ингибитор C1), белками клеточной поверхности: aIIb3, GPIba-IX-V, Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 ОБЗОРЫ 41 GPVI, TLT-1, p-селектин (P-selectin), медиаторами иммунного ответа и IgG [44]. Аот обладает множеством свойств, но именно регенеративные являются одними из самых ценных. Процесс регенерации ткани начинается с активации каскада коагуляции, формирования тромбоцитарного сгустка, агрегации тромбоцитов и их дегрануляции. В ходе дегрануляции из альфа-гранул активированного тромбоцита высвобождаются вышеупомянутые факторы роста. они являются лигандами к рецепторам, взаимодействие с которыми запускает каскад реакций. Выделенные факторы роста связываются с мембранными рецепторами с тирозинкиназной активностью, затем последовательно активируют белки-переносчики в цитоплазме и ядре, где запускается инициация генов, ответственных за контроль деления клеток. одновременно с вышеизложенными процессами в клетке происходит стимуляция транскрипции мрНК, активируются новые каскадные пути, которые стимулируют ангионеогенез, эндотелиза-цию, образование коллагена и клеточную миграцию, что приводит к регенерации ткани[28]. Высокий регенеративный потенциал Аот нашел свое применение в некоторых отраслях медицины, в частности в урологии. Нашим научным коллективом уже было проведено исследование по применению Аот в лечении пациентов с эректильной дисфункцией в 2014 г. В результате была оптимизирована технология получения Аот, доказана эффективность и безопасность применения данной методики [45], был получен патент [46]. M. Epifanova с соавт. (2019) было выполнено доклиническое исследование по изучению влияния различных типов Аот на сперматогенез на бусульфановой модели азооспермии крыс линии Wistar. 80 самцов крыс были случайным образом распределены на 5 групп по 18 особей в каждой [47]. Моделирование азооспермии проводили путем двукратной инъекции 10мг/кг бусульфана внутрибрюшинно четырем группам. Контрольной группе вводили 0,9% NaCl. Крыс с азооспермией разделили на 4 группы лечения: бестромбоцитарная плазма; аллоплазма, обогащенная тромбоцитарными факторами роста (Алот); активированная CaCl2 Алот (A-Алот); Алот с лейкоцитами (Л-Алот). В каждой группе вводили соответствующий продукт от инбредных крыс доноров 1 раз/ неделю в течение 6 недель (50 мкл/семенник). Через 2, 4 и 6 недель после индукции заболевания оценивали: вес особи, массу репродуктивных органов, общий тестостерон, клинический анализ крови, количество сперматозоидов в эпидидимисе, общую подвижность и морфологию сперматозоидов. Было отмечено увеличение количества сперматозоидов в группе с A-Алот и Л-Алот через 6 недель по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Доля патологических форм сперматозоидов возрастала к 6 неделе (р<0,05) и коррелировала со снижением их подвижности (р<0,05) в группах с бусульфаном. Гистологическое исследование семенников групп с бусульфаном показало снижение суммарной площади и среднего диаметра семенных канальцев, увеличение выраженности дезорганизации сперматогенного эпителия и отека паренхимы семенника (р<0,05). Был сделан вывод, что Аот является безопасной для восстановления сперматогенеза. Вместе с тем угнетение сперматогенеза оказалось избыточном при выбранной бусульфановой модели, а частые интра-тестикулярные инъекции клеточного препарата вызывали излишнюю травматизацию и индукцию воспаления. При проведении новых экспериментальных исследований необходимо учитывать данные рекомендации [47]. В турции M. Tek с соавт. (2009) была проведена работа по определению влияния VEGF-165 на сперматогенез и апоптоз в яичках крыс с варикозным расширением вен гроздевидного сплетения [48]. В эксперименте было задействовано 32 особи самцов крыс, у 20 было смоделировано варикоцеле путем частичной перевязки левой почечной вены в месте ее присоединения к нижней полой вене. разделение групп было следующим: 1 группа - контрольная (n=6); 2 группа - группа плацебо-операции (n=6); 3 группа - смоделированное варикоцеле (n=6); 4 группа - смоделированное варикоцеле и варикоцелэктомия через 4 недели (n=6); 5 группа - смоделированное варикоцеле и лечение инъекциями VEGF-165 (n=4); 6 группа - смоделированное варикоцеле, лечение инъекциями VEGF-165 (n=4) и варикоцелэктомия через 4 недели. Крысам 5 и 6 групп были проведены инъекции 0,4 мл VEGF-165 в паренхиму верхней, средней и нижней трети яичка после моделирования варикоцеле. Учеными была достоверно выявлена регрессия сперматогенеза в группе 3 при сравнении с контрольной группой и группой плацебо-операции, достоверных различий в группе плацебо-операции и группе 4 получено не было, а в 5 и 6 группах регрессия сперматогенеза была ниже, чем в группе плацебо-операции, однако различие не было достоверным. Индекс апоптоза оказался достоверно ниже в контрольной группе и группе плацебо-операции по сравнению с группой 3. Индекс апоптоза был достоверно ниже в 5 и 6 группах по сравнению с группой 3. Были сделаны выводы о том, что варикоцеле может угнетать сперматогенез, а VEGF-165 - играть положительную роль в восстановлении сперматогенеза и снижении индекса апоптоза [48]. Имеются данные об эффективности применения Аот для восстановления сперматогенеза, полученные в ходе доклинического исследования на мышах в одесском национальном медицинском университете. V. Zaporozhan с соавт. (2014) отобрали две экспериментальные и одну контрольную группы [49]. Экспериментальным группам выполнили внутрибрюшинные инъекции доксорубицина гидрохлорида (ДГ) для моделирования повреждения ткани яичка. Инъекции Аот вводили в мошонку мышей экспериментальной группы 2 троекратно с двухнедельным интервалом. При гистологическом исследовании тестикул животных в экспериментальной группе 1 на 4 и 6 неделе было отмечено снижение числа сперматогоний, клеток сертоли, расширение и заполнение белковым детритом семенных канальцев (6 неделя), отек интерстиция. В группе с Аот на 4 неделе было обнаружено: количество сперматогоний выше, чем у мышей остальных групп, число клеток сертоли не отличалось от контрольной; на 6 неделе - большое количество сперматоцитов 1 и 2 порядка, в просвете семенных канальцев находилась функциональная сперма [49]. C.A. Sekerci с соавт. (2016) из университета Мармара провели доклиническое исследование, в котором изучили влияние Аот на ткань яичек крыс после ишемического повреждения [50]. Моделирование осуществляли поворотом левого яичка на 4 ч., а также орхиэктомией правого яичка. Ишемическое повреждение вызвало в семенниках крыс достоверное увеличение активности ферментов ос (малондиальдегида, миелопероксидазы, каспазы-3) и существенное снижение активности антиоксидант-ных ферментов (глутатиона и супероксиддисмутазы). Интратестикулярное применение Аот скорректировало уровень супероксиддисмутазы и каспазы-3, активность миелопероксидазы и малондиальдегида. Уровень сывороточного тестостерона в группе без применения Аот был значительно ниже по сравнению с контрольной группой и группой с Аот. На основе уровня гормонов, биохимических данных ученые предположили, что интра-тестикулярные инъекции Аот действительно оказывают защитное действие на ткань яичек при ишемическом Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 42 ОБЗОрЫ и реперфузионном повреждениях за счет снижения нейтрофильной инфильтрации, ОС и усиления работы антиоксидантных механизмов [50]. В настоящее время в Испании проводится клиническое исследование, в ходе которого планируется определение эффективности применения плазмы, обогащенной факторами роста (plasma rich in growth factors, PRGF) для улучшения показателей подвижности сперматозоидов. Будет оценен процент подвижных сперматозоидов в образцах спермы с добавлением АОТ и без неё, до и после лечения пациентов. Результаты исследования еще не получены [51]. R. Al-Nasser с соавт. (2018) опубликовали данные исследования, проведенные на 71 мужчине, страдающих необструктивной формой азооспермии [52]. Всем пациентам, согласно протоколу, выполняли одну инъекцию 0,5 мл АОТ в каждое яичко, при наличии в анамнезе более двух операций экстракции сперматозоидов из яичка (testicular sperm extraction, TESE) - инъекции клеточного препарата повторяли. По результатам исследования получены следующие данные: побочных явлений или осложнений не зарегистрировано; уменьшился процент мужчин без сперматозоидов в эякуляте с 24,2% до 22%; снизился процент олигоспермии с 3,3% до 2,2%; 2,2% мужчин имели нормальную спермограмму; уровень ФСГ крови увеличился с 22,89±13,12 IU/ml до 24,56±23,43 IU/ ml. 23 пациента после окончания лечения не прошли контрольное обследование и, соответственно, их результаты отсутствуют. Авторы делают вывод о том, что АОТ-терапия является безопасной, однако статистически не была доказана эффективность лечения. Но данное исследование может послужить для начала крупномасштабных, многоцентровых клинических исследований [52]. Использование АОТ-терапии в урологии для улучшения показателей фертильности, восстановления сперматогенеза до сих пор остается методом, который изучен не до конца. Однако в акушерской и гинекологической практике накоплен больший опыт применения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, для реактивации или восстановления фоллику-логенеза. Так как у мужчин и женщин половые органы развиваются из общего зачатка - мезонефроса, а половые клетки (гоноциты, которые развиваются из внеза-родышевой энтодермы, соединительнотканные клетки, индифферентные клетки) имеют общее происхождение, считаем возможным и необходимым взять во внимание исследования применения АОТ в гинекологии [53]. M. Bakacak с соавт. (2016) было проведено доклиническое исследование по эффективности применения АОТ для восстановления функций яичников после временной ишемии [54]. Для эксперимента было отобрано 60 самок крыс, случайно распределенных по 6 группам, по 8 особей в каждой, 12 оставшихся были донорами крови для приготовления АОТ. 1 группа - плацебо-операция, 2 - ишемия, 3 - ишемия и реперфузия, 4 - плацебо-операция и использование АОТ, 5 - ишемия и использование АОТ за 30 мин. до ишемии, 6 - ишемия и реперфузия и использование АОТ за 30 мин. до реперфузии. Условия ишемии и реперфузии моделировали операцией, в ходе которой осуществляли перекрут яичника самок крыс, длительностью 3 ч. Были получены следующие результаты: общий оксидативный статус (total oxidant status), индекс ОС (oxidative stress index) и степень нарушения гистоархитектоники яичников (total ovarian histopathological scores) были выше в 2 и 3 группах по сравнению с группой 1. Инъекция АОТ достоверно снизила общий оксидатив-ный статус, индекс ОС и повреждение ткани яичников согласно гистологическому исследованию в группах 5 и 6, по сравнению с группами 2 и 3, соответственно. Кроме того, в группах 5 и 6 повысился уровень эндотелиального сосудистого фактора роста, что свидетельствует о более высоком уровне процессов репарации тканей. Учёные пришли к выводу, что АОТ эффективна для предотвращения повреждения, вызванного ишемией и реперфузией, яичника самок крыс [54]. K. Pantos с соавт. (2016) оценили влияние АОТ-терапии на восстановление функций яичников и реактивацию фолликулогенеза у женщин в переменопаузе [55]. В исследовании приняли участие 8 женщин в перемено-паузе, которым провели трансвагинальную инъекцию АОТ в яичники под контролем УЗИ. Восстановление функций яичников было подтверждено наступлением менструального цикла через 1 -3 мес. после инъекции. Авторы сделали предположение, что АОТ-терапия обогащает дисфункциональную, переменопаузную ткань яичников необходимыми факторами для роста сосудов и их функционирования, в отсутствии которых ткань постепенно дегенерирует. В результате проведенного лечения у женщин временно восстановилась функция яичников, появилась возможность развития новых примордиальных и антральных фолликулов. Данная работа впервые продемонстрировала успешное временное восстановление активности яичников у женщин в пере-менопаузе после АОТ-терапии. Ученые предполагают, что после подтверждения предварительных результатов исследования на большей выборке пациентов АОТ будет использоваться как терапия выбора для регенерации яичников и реактивации фолликулогенеза у пациенток [55]. Ученые из США, Калифорния [56], в настоящее время проводят клиническое исследование, в основу которого лег труд K. Pantos с соавт. (2016) [55]. Цель работы - оценка эффективности нового комбинированного метода лечения бесплодия женщин в период менопаузы, перименопаузы и преждевременной менопаузы. Предложенный метод основан на совместном использовании АОТ, вспомогательных репродуктивных технологий (оплодотворение in vitro - ЭКО) и преимплантационного генетического скрининга. В данном исследовании примут участие 50 женщин. Результаты группы с лечением будут сравнивать с контрольной группой, состоящей из 25-50 женщин, которые ранее уже прошли процедуру ЭКО с положительным результатом. В ходе данного сравнения будет выявлена общая эффективность восстановления функций яичников. Исследование окончено, промежуточные результаты не опубликованы [56]. Несмотря на отточенность техники хирургических вмешательств и положительные результаты оперативного лечения варикоцеле, остается ряд пациентов, проблема бесплодия которых не решается в полной мере операцией. В связи с этим, ведется поиск новых подходов к лечению данной патологии. Безусловно, технологии регенеративной медицины, уже подтвердившие свою безопасность и эффективность в многочисленных доклинических и клинических исследованиях, представляют интерес для решения данной проблемы и обладают огромным потенциалом использования. Нашим коллективом в настоящий момент проводится клиническое исследование по оценке безопасности и эффективности применения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, при варикоцелэктомии, промежуточные результаты еще не опубликованы. Получен патент на изобретение РФ № 2735888. Москва. 09 ноября 2020. // Бюллетень № 31 от 09.11.2020. Способ протекции и восстановления сперматогенеза при оперативных вмешательствах на семенном канатике, яичке, придатке яичка

About the authors

M. V Epifanova

Peoples' Friendship University of Russia; P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute - Branch of the National Medical Research Radiological Centre

Email: epifanova_maya@mail.ru

A. A Kostin

Peoples' Friendship University of Russia; National Medical Research Radiological Centre

M. E Chalyy

Medical Research and Education Center of M.I. Lomonosov Moscow State University

B. R Gvasalia

Peoples' Friendship University of Russia

E. V Gameeva

P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute - Branch of the National Medical Research Radiological Centre

S. A Artemenko

Central State Medical Academy of the Business Administration of the President of the Russian Federation

A. A Epifanov

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

References

Supplementary files