Extracellular ATP molecules effects the functional properties of granulocyte plasma membrane

Full Text

Введение АТФ может выступать в качестве внеклеточной вазоактивной сигнальной молекулы, которая выступает регулятором артериального давления на уровне кровеносных сосудов [1], индуцируя ангиогенные сигналы эндотелиальным клеткам [2]. Клетки высвобождают АТФ в ответ на механический стресс [3] или биогенную активацию [4]. Эффекты внеклеточной АТФ зависят от типа Р2 рецепторов, представленных на клеточной поверхности [5], и наличия эктонуклеотидаз, гидролизующих АТФ [6]. Межклеточная молекула АТФ может сенсибилизировать или десенсибилизировать различные сигнальные пути, оказывая опосредованное влияние на функциональные свойства клеток [7]. Локализуясь во внеклеточном пространстве, АТФ участвует в передаче информации между клетками и инициации эндогенных тканевых сигналов, запускающих каскад реакций пуринергического пути [8]. В частности известно, что АТФ стимулирует процесс хемотаксиса, образование активных форм кислорода гранулоцитами, синтез цитокинов иммунными клетками при развитии воспаления [9]. В связи с этим, актуальным остается вопрос о влиянии молекулы АТФ на свойства клеточной поверхности гранулоцитов. Цель исследования состояла в изучении влияния внеклеточной АТФ на функциональные свойства (жесткость, потенциал поверхности, адгезивные свойства, осмо-регуляторные возможности мембраны) плазмалеммы и миграционную активность гранулоцитов в опытах in vitro. Материал и методы Влияние внеклеточной молекулы АТФ на функциональные свойства плазмалеммы гранулоцитов изучали Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ на образцах крови здоровых людей (n=30) в возрасте от 25 до 45 лет (18 женщин, 12 мужчин). Кровь отбирали путем венепункции в количестве 2 мл в вакуумные пробирки Vacuette K3E с сухим напылением ЭДТА К3 (Greiner Bio-One, Австрия) в конечной концентрации 2,0 мг/1 мл образца крови на базе областной клинической больницы Белгорода с участием специализированного медперсонала. Исследование выполнено с соблюдением требований Хельсинской декларации, получено предварительное добровольное информированное согласие участников исследования в соответствии с рекомендациями, изложенными в Декларации по этическим принципам медицинских исследований, в которых участвуют люди, принятой 52 Генеральной Ассамблеей Всемирной Медицинской Ассоциации (Эдинбург, Шотландия, октябрь, 2000). Гранулоциты получали с помощью центрифугирования цельной крови при 1500 об./мин. в течение 15 мин. Клетки отбирали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 (ПанЭко, россия). Каждую пробу делили на две части - контрольную и опытную (106 кл./мл). В опытных пробах моделировали экзогенную нагрузку с АТФ in vitro, добавляя 10,0 мМ аденозин-5-трифосфата динатриевую соль тригидрата (АТФ-№2х3Н20) (Sigma, США) к суспензии гранулоцитов. Контролем служила суспензия гранулоцитов в среде RPMI 1640 без добавления АТФ-№2х3Н20. Инкубацию всех проб проводили в течение 15 мин. при 37°С. После инкубации изучали функциональные свойства плазмалеммы гранулоцитов (жесткость, потенциал поверхности, силу межклеточной адгезии) с использованием атомно-силового микроскопа ИНТЕГРА ВИТА (АСМ, конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71) (NT-MDT, Россия). Жесткость клеточной мембраны оценивали по числовым данным модуля Юнга, полученным при измерении на АСМ в режиме силовой спектроскопии [10]. Для сканирования применяли модифицированные АСМ-зонды, изготовленные на основе полимерных микросфер с радиусом закругления 5 мкм. Из каждой пробы сканировали по 20 гранулоцитов. Для измерения потенциала поверхности клеток суспензию клеток отмывали 10 мл изотоничного раствора хлорида натрия (ПанЭко, Россия) в течение 5 мин, фиксировали 0,25% раствором глутарового альдегида (MERCK, Германия) в течение 20 мин., дважды отмывали 10 мл изотоничного раствора хлорида натрия по 5 мин. и готовили препараты на обезжиренной металлической подложке. Потенциал поверхности гранулоцитов измеряли на АСМ в режиме зонда Кельвина. Сканирование осуществляли кантилеверами с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, США). Из каждой пробы сканировали по 20 гранулоцитов. Расчет потенциала поверхности и обработку полученных сканов проводили в программе Nova (NT-MDT, Россия). Силу межклеточной адгезии измеряли на АСМ в режиме силовой спектроскопии в системе «эритроцит-гранулоцит», регистрируя силовые кривые с поверхности 20 клеток. Для сканирования конструировали биосенсор-ный чип, изготовленный на основе нативного эритроцита и типлесса CSG11 (Tipsnano, США) [11]. Расчет данных осуществляли с помощью программного обеспечения Nova (NT-MDT, Россия). Осморегуляторные свойства мембраны грануло-цитов изучали в тестах с гипоосмотической нагрузкой in vitro: суспензию лейкоцитов из каждой опытной и контрольной пробы делили на 2 части (по 0,5 мл) и к первой пробе добавляли 0,5 мл аутогенной плазмы, а ко второй - 0,5 мл 0,45% гипотонического раствора хлорида натрия (гипоосмотическая нагрузка). В стерильные чашки Петри со стеклянным дном (Eppendorf, Германия) вносили 0,1 мл клеточной суспензии из соответствующих опытной и контрольной проб. Полученные суспензионные препараты микроскопировали, регистрируя изображения нативной суспензии лейкоцитов с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon (TokyoByoke, Япония, 2011) через каждые 30 сек. Длительность гипоосмотической нагрузки составила 5 мин. Используя программное обеспечение Nis-Elements Documentation (ver. 2.32 TokyoByoke, Япония), на полученных изображениях измеряли диаметр 50 клеток из каждой пробы. На основе промеров диаметров рассчитывали объем клетки и мембранный резерв, заложенный в складчатости плазмалеммы и используемый клетками в регуляции объема клеток при гипоосмотической нагрузке, по формуле: mp = 5г - Sri , п где МР - мембранный резерв клетки, мкм-1; Sr - площадь поверхности клетки в гипотонической среде, мкм2; Sri - площадь поверхности клетки в аутогенной плазме, мкм2; Vri - объем клетки в аутогенной плазме, мкм3. Миграционную активность гранулоцитов оценивали в прямом капиллярном тесте под агарозой при жизнеспособности клеток не менее 95%. Жизнеспособность клеток определяли с помощью счетчика и анализатора жизнеспособности клеток Countress II Automated Cell Counter (Thermo, Life Technologies, США, 2019), добавляя к 1 мкл клеточной суспензии 5 мкл 0,4% раствора трипанового синего (Invitrogen, США), Количество мигрировавших клеток в 1 мкл среды считали в 25 больших квадратах сетки камеры Горяева под большим увеличением х800. Статистический анализ Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность различий между контрольными и опытными пробами определяли с использованием t-критерия Стьюдента при p<0,05 в случае нормального распределения признака и U-критерия Манна-Уитни при p<0,05 для непараметрических данных. В работе приведены средние величины (М) и величины статистической ошибки средней (m). Результаты В пробах крови, проинкубированных с АТФ, было обнаружено снижение жесткости клеточной поверхности гранулоцитов на 53,2% (р<0,05), снижение потенциала поверхности на 32,5% (р<0,05), увеличение силы адгезии между эритроцитами и гранулоцитами на 43,3% (р<0,05) и возрастание миграционной активности клеток на 74,8% (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 1). Изменение свойств плазмалеммы под влиянием внеклеточной АТФ отразилось на способности гранулоцитов регулировать свой объем в условиях гипоосмотической нагрузки. В опытных пробах в гипотонической среде наблюдали фазу регуляторного сокращения объема в первые 60 сек. инкубации, затем клетка восстанавливала свой объем к 90 сек. до значений, характерных до инкубации (табл. 2). В интервале 120-150 сек. инкубации наблюдали фазу регуляторного сокращения объема Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 Таблица 1. Функциональные свойства поверхности гранулоцитов. Параметр Контроль, n=600 Опыт (АТФ), n=600 Модуль Юнга гранулоцитов, мПа 4,55 ± 0,04 2,97 ± 0,03* Потенциал поверхности, мВ -30,98 ± 2,58 -45,87 ± 1,44* Сила адгезии в системе «эритроцит-гранулоцит», нН 30,7 ± 0,5 54,2 ± 0,7** % мигрировавших гранулоцитов 10,4 ± 0,2 41,3 ± 0,8* Примечание: * - статистически значимые различия между показателями по t-критерию Стьюдента (р<0,05);** - статистически значимые различия между показателями по U-критерию Манна-Уитни (р<0,05); n - количество просканированных клеток. Таблица 2. объем гранулоцитов в тестах с осмотической нагрузкой in vitro. Контроль Нагрузка с АТФ Время, с - V плазма, мкм3 V гипо, мкм3 V плазма, мкм3 V гипо, мкм3 0 484,4 ± 8,1 652,4± 12,4 602,2 ± 12,2 752,7 ± 15,9 30 493,9 ± 8,7 669,9 ± 13,6* 626,3 ± 13,4* 751,7 ± 18,3 60 517,4 ± 8,8* 642,7 ± 12,2* 612,1 ± 12,6* 722,8 ± 15,9 90 514,4 ± 8,9* 636,5 ± 12,9* 616,9 ± 12,8* 752,7 ± 18,1 120 526,3 ± 9,0* 613,2 ± 11,3* 612,8 ± 13,2* 729,4± 16,7 150 505,5 ± 8,9* 626,8 ± 12,3* 612,2 ± 12,3* 728,4± 15,3 180 505,1 ± 8,2* 623,8 ± 12,6* 627,9 ± 12,9* 740,2 ± 17,8 210 485,8 ± 8,2 627,4 ± 13,4* 599,7 ± 11,1 714,1 ± 16,2 240 498,6 ± 8,2 623,5 ± 11,2* 620,2 ± 11,7* 703,1 ± 14,2 270 484,0± 8,1 622,4± 12,3* 603,5 ± 11,9 746,9 ± 15,5 300 489,9 ± 7,9 614,9 ± 12,6* 596,3 ± 12,4 719,8 ± 15,7 Примечание: * - статистически значимые различия между показателями в начале инкубации (0 сек.) и последующими временными интервалами по t-критерию Отьюдента (p<0,05); V плазма - объем клетки в аутогенной плазме; V гипо - объем клетки в гипотонической среде. клетки, которая сменилась коротким 30 сек. периодом регуляторного увеличения объема к 180 сек. В интервале 210-240 сек. был установлен 30 сек. период уменьшения объема, который длился до конца инкубации. В конечном итоге, к 300 сек. объем клетки был снижен и не восстановился до исходных значений (табл. 2). В пробах с аутогенной плазмой под влиянием внеклеточной АТФ была установлена длительная фаза регуляторного увеличения объема клетки с 30 по 180 сек. инкубации. Через 210 сек. объем клетки возвращался к исходным значениям, к 240 сек. объем клетки вновь возрастал, и к концу инкубации (270-300 сек.) вновь возвращался к исходным значениям. В контрольной группе проб в гипотонической среде наблюдали короткий период регуляторного увеличения объема в первые 30 сек. инкубации, который сменился длительной фазой регуляторного сокращения объема в период с 90 по 300 сек. инкубации. В контрольных пробах с аутогенной плазмой был установлен период регуляторного увеличения объема длительностью 120 сек. (с 60 по 180 сек. инкубации). К 210 сек. объем клетки восстановился почти до исходных значений и существенно не изменился до конца инкубации. Анализируя динамику изменения мембранного резерва, задействованного гранулоцитами в регуляции объема, было установлено, что под влиянием внеклеточной АтФ вовлечение мембранных структур в регуляцию клеточного объема снижается на протяжении всего времени инкубации по сравнению с контролем (рис. 1). В условиях экзогенной нагрузки АТФ вовлечение мембранного резерва гранулоцитами в регуляцию объема было снижено примерно в 1,4 раза на 30 и 210 сек. инкубации и в 1,2 раза на 270 сек. по сравнению с контролем. К концу инкубации достоверных различий в использовании мембранного резерва клетками в регуляции их объема установлено не было. Обсуждение В проведенном исследовании изучали функциональные свойства плазмалеммы гранулоцитов, их способность регулировать объем, а также миграционную активность клеток в условиях активации элементов пури-нергического сигнального каскада. Смоделированная экзогенная нагрузка АТФ соответствовала физиологической концентрации (~10 мМ), которую фиксируют при высвобождении АТФ во время деформационного стресса из клеток крови в сосудах микроциркуляторного русла [12]. Под влиянием внеклеточной АТФ снизились жесткость и заряд клеточной поверхности, увеличилась сила адгезии лейкоцитов. основным фактором, определяющим упруго-эластические свойства клеточной поверхности, является архитектоника подмембранного актинового цитоскелета. Мы полагаем, что в условиях экзогенной нагрузки с АТФ установленное снижение жесткости клеточной поверхности является результатом активации пуринергического сигнального каскада, Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МР, мкм 1 70 60 50 40 контроль опыт 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 с Рис. 1. Мембранный резерв, используемый гранулоцитами в гипоосмотическом тесте (in vitro): опыт - нагрузка с АТФ, контроль - интактная кровь; МР - мембранный резерв клетки, мкм-1; * - статистически значимые различия между показателями по t-критерию Стьюдента (p<0,05) запускаемого через рецепторы, имеющие высокое сродство для ионов Са2+. В литературе описаны семейства Р2-рецепторов, которые индуцируют увеличение уровня внутриклеточного Са2+ в нейтрофилах человека [1 3]. Рецептор Р2Х4, представляющий ионный канал, открывается в ответ на связывание с АТФ [14] и имеет высокую проницаемость для Са2+ [15]. Кроме того, рецептор Р2У2, связанный с G-белком, при взаимодействии с молекулой АТФ, вызывает внутриклеточную мобилизацию Са2+ [16]. Доказано, что активация пуринергических рецепторов способствует разборке полимеризованного актина [1 7] и снижению концентрации актин сшивающих белков [1 8]. Если предположить, что снижение жесткости клеточной поверхности тесно связано с реализацией внутриклеточного Са2+-каскада, то в условиях гипотонической нагрузки этот сигнальный путь будет запускать фазу регуляторного сокращения объема, что мы и наблюдали в эксперименте. Известно, что сжатие клетки и уменьшение ее объема связано с увеличением оттока К+ и Cl- [19]. В нейтро-филах повышение уровня Са2+ увеличивает активность Са2+-активируемых К+-каналов и Ch-каналов, что приводит к сжатию клетки и развитию фазы регуляторного снижения объема [20]. Кроме того, дополнительный вклад в увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ в гранулоцитах может принадлежать TRPV6-катионному каналу, который функционирует как механо-осмотиче-ский датчик в условиях гипотонической среды [21]. Функционирование объем-чувствительных белков тесно связано с миграционной активностью клетки, которая запускается пуринергическим сигнальным каскадом. В работе P. Stachon с соавт. (2016) в опытах in vivo доказана роль АТФ в миграции и адгезии нейтро-филов [22]. Имеются данные о том, что внеклеточная АТФ регулирует функцию селектина и миграцию нейтрофилов посредством Р2Х7 рецептора [23]. В литературе представлены данные об усилении хемотаксиса нейтрофилов под влиянием внеклеточной АТФ посредством активации, опосредованной P2Y2 рецептором, передающим сигнал на mTOR сигнальный путь на лидирующем крае клетки [24]. Отмечается, что нейтрофильные эктонукле-отидазы гидролизуют АТФ до аденозина, который через А3-рецепторы также способствует миграции клеток. Хемотаксис нейтрофилов требует возбуждающих сигналов на лидирующем крае клетки и ингибирующих сигналов в противоположной части. Рецепторы P2Y2, а также A3-рецепторы, вносят вклад в возбуждающие сигналы лидирующего края клетки, в то время как аденозин, воздействуя на A2A-рецепторы, вносит вклад в ингибирующие сигналы в противоположной части клетки [25]. Таким образом, под влиянием внеклеточной АТФ было установлено снижение жесткости и потенциала поверхности плазмалеммы, усиление адгезивных свойств и миграционной активности гранулоцитов, снижение использования мембранного резерва клеткой в гипотонической среде. С точки зрения физиологии микроциркуляции выявленные изменения функциональных свойств плазмалеммы гранулоцитов в условиях запуска пуринергического сигнального каскада позволяют более «мягким» клеткам легче деформироваться в мелких сосудах. Отрицательный заряд и усиление адгезивных свойств плазмалеммы, на фоне увеличения миграционной активности, указывают на триггерную роль внеклеточной АТФ в развитии воспаления в сосудистой стенке.

About the authors

M. Yu Skorkina

Belgorod State National Research University

Email: skorkina@bsu.edu.ru

T. S Shevchenko

Belgorod State National Research University

V. V Fetter

Belgorod State National Research University

O. V Cherkashina

Sv. loasaf Belgorod Region Hospital

M. Yu Palchikov

Belgorod State National Research University

References

Supplementary files