Cilia and ciliopathy

Full Text

Введение Цилии (реснички) - это органеллы, характерные исключительно для эукариот и встречающиеся у простейших, на соматических и половых клетках многоклеточных, а также на гаметах многих растений [1, 2]. Обязательными элементами цилии являются базальное тельце (БТ) и аксонема. БТ служат интегративным элементом, механически и функционально соединяющим цилию с клеткой. Со стороны клетки БТ, состоящее из центриоли, закрепляет цилию в цитоскелете и выполняет функцию селектора между цитоплазмой клетки и цилии. Для аксонемы БТ играет роль матрицы, задающей конфигурацию образующих её микротрубочек. Сама аксонема, образованная девятью расположенными по окружности дуплетами микротрубочек, покрытыми клеточной мембраной, является подвижной внеклеточной частью цилии, через которую реализуются её моторные или сенсорные функции (рис. 1). Начало изучения цилий связано с Антони ван Левенгуком, который в 1674-1675 годах обнаружил их на клетках простейших и, обозначив словом «tayl», описал как «структуры, в несколько раз превышающие длину клетки» [3, 4]. Введение самого термина «цилия» приписывают Отто Мюллеру, употребившему его в тексте 1786 года [4, 5] (рис. 2). Значительно позже, в 1841 году, был предложен термин «флагелла» [4, 6]. Начиная с этого времени в зарубежной литературе термин цилия использовался для описания множества этих органелл на клетке, в то время как флагелла - в случае единичной органеллы. В дальнейшем было показано принципиальное сходство в их строении [4]. Сейчас термин флагелла используют при описании органов движения сперматозоидов и протист. Также флагеллами называются морфологически похожие структуры у бактерий, имеющие, однако, принципиально иную структуру [7, 8]. Для русскоязычной литературы характерно использование терминов жгутик и реснички. Первым часто обозначают флагеллы простейших и бактерий, а также хвост сперматозоида, второй термин синонимичен цилиям. Отдельно выделяют археллум - аналогичную флагелле по функциям органеллу архей, имеющую независимые эволюцию и строение [8]. Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 ОБЗОРЫ 21 Аксонема Рис. 1. Строение цилии: A - структура цилии; B - структура аксонемы подвижной цилии и сенсорной цилии (*); C - структура базального тельца. Примечание: ИФТ - интрафлагеллярный транспорт У человека цилии есть почти на всех клетках [9]. Абсолютное их большинство представлено сенсорными цилиями, выполняющими роль органелл, воспринимающих физические и химические изменения характеристик внешней среды, а также сигнальные молекулы [10]. Функцией подвижных цилий является создание направленного тока жидкости. Это объясняет их присутствие на реснитчатых эпителиоцитах и эпителии маточных труб, а также на эпендимоцитах [11]. Практический интерес изучения цилий связан с цилиопатиями - гетерогенной группой малоизученных патологических состояний, обусловленных нарушениями развития, строения и функционирования цилий. Наиболее известные и охарактеризованные заболевания этой группы - поликистозная болезнь почек, нефронофтиз, синдромы Барде-Бидля, Жубера, Мекеля, Картагенера, синдром Кароли [12]. Современные подходы к лечению этих заболеваний ограничиваются симптоматической терапией, однако расширяющееся понимание реализации цилиарной генетической программы и связи её дефектов с патоморфогенезом разных цилиопатий создает основу для разработки гентерапевтических препаратов, потенциально способных к коррекции цилиопатий [13]. Краткий очерк происхождения и эволюции цилий На сегодняшний день отсутствует общепринятое объяснение эволюционного происхождения цилий, а имеющиеся теории носят, скорее, гипотетический характер [14]. Согласно первой гипотезе, цилии сформировались на основе имеющихся в клетке структур цитоскелета. Согласно второй, происхождение цилий связано с внедрением в клетку вируса, синтез белков которого со временем подчинился ядерному генетическому аппарату. Её авторы аргументируют это самосборкой Бт и аксонемы и присутствием в микротрубочках БТ белков, отсутствующих в цитоплазматических микротрубочках. По их представлениям, аксонема является результатом неполного отделения вируса от плазматической мембраны [14, 15]. Предполагают, что эволюция цилий эукариот шла независимо от эволюции прокариотических флагелл, обладающих принципиально отличным строением. В результате сравнительных биоинформатичечких исследований было определено, что существует репертуар структурных генов цилий, общий для разных групп эукариот и сохраняющийся на протяжении всей их эволюции [16-18]. Формирование цилий эволюционно крайне продолжительный процесс. Гипотетически флагелле ранних эукариот предшествовала протофлагелла - выпячивание цитоплазматической мембраны, содержащее микротрубочки. Она не давала возможности передвижения, однако могла использоваться для прикрепления к субстрату или для питания за счет ретроградного транспорта, переносящего внутрь клетки адгезирован-ные на поверхности цилии питательные элементы [17]. Протофлагелла стала основой для множества последующих надстроек и усовершенствований. Её появление было связано с приобретением клеткой полярности, формированием отдельного мембранного домена, позволившего сосредоточить на нем набор рецепторов для приема и передачи сигнала, участком изолированной Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 22 ОБЗОРЫ ANMALCULA INFUSORIA FLUVIATILIA et MARINA, QUÆ DETEXIT, SYSTEMATICE DESCRIPS1T et AD VIVUM DELINEAKI CURAV1T OTHO FRIDERICUS MULLER, REGI DANIÆ QUONDAM A CONSlLIIS CONFÊRIÎNTÎÆ, FLURÏUMQUE ' ACADEMÎASUM ET SûCÎETATUM SCIENTLVROM SüÛALIS, SlSTIT. ■ OPUS HOC POSTHUMUM quod CUM TAFUL1S ÆNEIS L. in lucem tradw , VIDUA EJUS NOBILTSSIMA, CURA Othonis Fabriciï. ГЛЖН115 ORPHANOTROniIII RECH IMUN, ET »DAUS SQÜG REO. SCIENT. KAUN. NATURAiUUl CURTOSOR SEROUK. HA U NUE, T«n NfCO&AI MÖLLEItt, Amt SUet* bvecmwn 1786. Рис. 2. Титульный лист работы «Animalcula infusoria Fluvia Tilia Et Marina: Quae Detexit, Sustematice Descripsit Et Ad Vivum Delineari Curavit Otho Fridericus Muller, ...» - «Наливочные [зверушки] и водные существа, обнаруженные, описанные и старательно зарисованные Отто Фредериком Мюллером.», 1786. Табл. XLIX: с - цилия цитоплазмы и наличием ассоциированного с микротрубочками интрафлагеллярного транспорта (ИФТ). По-видимому, значительный вклад в молекулярную эволюцию цилий внес механизм дупликации генов. Образующиеся копии генов могли изменяться и образовывать новые цилиарные белки. Так, для хламидомонады (Chlamydomonas sp.) были описаны несколько видов генов динеинов аксонемы, среди которых нельзя было выделить основной, чье выключение приводило бы к потере функции цилии [19]. В описываемом случае динеины являлись по отношению друг к другу дублирующими. Такая изменчивость привела к большему функциональному разнообразию белков внутри органеллы, что позволило сформировать более тонкие надстройки регуляции органеллы и открыло возможность для использования цилии в качестве органеллы движения или инструмента реактивности [17, 20]. Цилиогенез и строение цилий Цилиогенез - процесс формирования цилий, происходящий во время интерфазы клеточного цикла. В нем принято выделять четыре последовательных этапа: формирование центриолей (центриологенез), их миграция к плазматической мембране, формирование структур, ассоциированных с БТ, и элонгация аксонем (рис. 3) [21, 22]. Центриологенез необходим для образования цен-триолей, из которых впоследствии формируются БТ. Описаны два пути центриологенеза: ацентриолярный - когда центриоли образуются de novo и центриолярный, при котором уже имеющиеся в клетке центриоли являются центром организации для новообразующихся центриолей. Центриолярный путь реализуется во время деления клетки и позволяет образоваться только одной новой центриоли [22, 23]. Мультицилиарным клеткам в респираторном тракте, желудочках головного мозга и маточных трубах требуется единовременное образование большого количества центриолей для формирования порядка 300 цилий [24]. Это достигается за счет дейте-росом - станций амплификации центриолей. Дейтеросомы образуются после деления клетки и представляют собой кольцевидные комплексы, включающие белки Deup1, CEP152, PLK4, Sas6 [25, 26]. Центриоли, сформированные вокруг дейтеросом, отсоединяются от них. Главной особенностью центриолярного пути является использование уже имеющейся в клетки центриоли в качестве станции сборки [24, 27, 28]. Для гена Deupl показана его паралогичность к Cep63, чей продукт регулирует центриолярный путь [27]. Это позволяет сделать вывод об относительной эволюционной новизне ацентриолярного пути центриологенеза и предположить его происхождение от центриолярного. Отделившиеся от дейтеросом центриоли движутся к апикальному полюсу клетки и прикрепляются к внутренней стороне клеточной мембраны, формируя БТ. Миграция центриолей связана с актиновым цитоскелетом, в то время как микротрубочки в ней не задействованы [29-31]. Дистальные придатки (distal appendages, DAP) - флагоподобные структуры, закрепляющие центриоли в апикальной мембране клетки. Помимо фиксации DAP отводится роль участников цилиарной пропускной системы [32, 33]. Успешная фиксация запускает дальнейшее формирование цилии [34]. Каждый триплет БТ состоит из трех микротрубочек, образованных гетеродимерами а- и ß-тубулина: одной замкнутой, состоящей из тринадцати протофиламен-тов, и двух не замкнутых, состоящих из одиннадцати протофиламентов и примыкающих друг к другу. Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 ОБЗОРЫ 23 Замкнутая микротрубочка обозначается как A, примыкающие - B и C соответственно [35]. Помимо центральной конструкции, образованной микротрубочками, с БТ ассоциированы три группы белков [36]. К первой относятся структурные компоненты центриолей, включающие тубулин типов а, ß, у, 5 и в и тектин [37, 38]. Вторая состоит из подвижных белков ИФТ и ассоциированных с ними белками синдрома Барде-Бидля (BBS), а также белков перицентри-олярного матрикса [34]. Третью группу образуют DAP, SAP и структуры, которые, в отсутствие устоявшегося перевода, коллектив авторов предлагает обозначить как «исчерченные корешки» (striated rootlets) [33, 39]. В некоторых источниках встречается описание структур, обозначаемых как базальные ножки (basal feet) [40-43]. Они начинаются от средней части БТ, на уровне SAP [40]. В литературе отсутствуют объективные свидетельства о том, что это разные образования, однако в то же время некоторые авторы предполагают их самостоятельность [41, 42]. Выключение гена Odf2, необходимого для прикрепления обеих структур к БТ, привело к их отсутствию, хаотичному расположению микротрубочек, нарушению изгибания цилий на мембране реснитчатого эпителия и ухудшению мукоцилиарного транспорта [41, 43, 44]. Это позволяет предположить функциями описываемых структур соединение БТ цилий с микротрубочками, определение их паттерна расположения и сонаправленного движения [44, 45]. БТ опосредует соединение аксонемы с апикальной частью клетки, интегрирует цилию в сеть цитоскелета и является матрицей для формирующейся аксонемы [42, 44, 46]. Экспериментальное нарушение структуры БТ Chlamydomonas sp. приводило к вариациям в количестве микротрубочек в нем и в аксонеме [38]. Цилиогенез завершается элонгацией аксонемы по вне- и внутриклеточному путям [28, 47, 48]. В обоих случаях начало элонгации связано с удалением белка CP110, кэпирующего дистальную часть БТ [49, 50]. В случае внеклеточного пути сформировавшееся БТ сразу связывается с клеточной мембраной. При внутриклеточном пути БТ ассоциирует с цилиарным пузырьком, который вытягивается при увеличении длины аксонемы, а затем сливается с клеточной мембраной, оставляя у основания цилии небольшую инвагинацию мембраны, обозначаемую как цилиарный карман [51]. Структурные различия между подвижными (двигательными) и сенсорными цилиями обусловлены их функциями. Подвижные цилии из-за необходимости в синхронном однонаправленном движении обладают дополнительной центральной парой микротрубочек, радиальными спицами, а также наружными и внутренними динеиновыми ручками (outer and inner dynein arms) [36, 52-54]. Молекулы динеина прикреплены к А-трубочкам, а их ручки направлены к В-трубочкам, по которым происходит их скольжение. АТФ-индуцированное изменение конформации динеинов одной стороны приводит к изгибанию цилии в эту сторону [55]. Радиальные спицы, тянущиеся от дуплетов микротрубочек к центральной паре, синхронизируют движение микротрубочек [52, 56, 57]. Сенсорные цилии не содержат центральной пары микротрубочек, динеиновых ручек и радиальных спиц [11, 58]. Промежуточное положение между сенсорными и подвижными цилиями занимают узелковые цилии, расположенные в эмбриональном узелке млекопитающих - структуре, определяющей формирование билатеральной асимметрии. Они не имеют центральной пары микротрубочек, а также радиальных спиц, однако обладают динеиновыми ручками, что связано с их вращательным движением [58]. В литературе отсутствуют свидетельства о наличии в цилии собственного белоксинтезирующего аппарата, что создает необходимость в транспорте белков из цитоплазмы [59, 60]. Для этого в цилии действует ИФТ - комплекс транспортных белков, переносящих компоненты аксонемы, белки цилиарной мембраны и сигнальные белки [52]. Молекулярными переносчиками ИФТ являются кинезин 2, движущийся антероградно по A-трубочке, и динеин 2 (также обозначается как 1b), движущийся ретроградно по B-трубочке [61-66]. ИФТ связывает аппарат Гольджи и цилио-плазму. Везикулы с белками из аппарата Гольджи Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 24 ОБЗОРЫ транспортируются к БТ, где, предположительно, соединяются с моторными белками под действием белка IFT20 [67]. Кроме основных моторных белков и ассоциированных с ними элементов, значительная, однако до конца не ясная роль в ИФТ, отводится белкам синдрома Барде-Бидля (Bardet-Biedl syndrome proteins, BBS) [52, 68-70]. Функционирование сенсорных цилий в норме Сенсорные цилии - инструмент реактивности клетки, с помощью которого она воспринимает изменения физических и химических факторов и преобразует их во внутриклеточные сигналы, позволяющие скорректировать метаболизм клетки сообразно изменившимся условиям. Дальнейшее деление функций цилий на механосенсорную, хемосенсорную и специализированные основывается на характере воспринимаемой информации. Ответ клетки на эти сигналы, по-видимому, носит черты универсальности. Он реализуется через классические сигнальные пути (Wnt, Hh, Hippo, mTOR, JAK/STAT, MAPK и др.) или повышение концентрации ионов Ca2+ внутри клетки. Это приводит к изменениям экспрессии генов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и гибель клетки [71]. Механосенсорная функция цилии Сенсорные цилии эпителия почечного гистогенетического типа (нефротелий) являются одним из наиболее изученных случаев их функциональной значимости [72, 73]. В серии экспериментов, проведенных на культуре клеток MDCK (почки собаки Мадина-Дарби, Madine-Darby canine kidneys), изгибание цилии обуславливало вход механочувствительных кальциевых каналов, что приводило ко входу кальция внутрь клетки [75, 76]. Одновременно с этим происходило увеличение внутриклеточной концентрации кальция в прилежащих клетках за счет распространения ионов через щелевые контакты и развития кальций-индуцированного высвобождения ионов. Ответом на повышение внутриклеточной концентрации кальция предполагают изменение строения клеток, приводящее к изменению диаметра трубочек в нефроне, сообразно давлению находящейся в них мочи [73]. Механизм притока кальция в клетку в ответ на изгиб цилии, по-видимому, характерен для всех клеток, в функции которых входит механодетекция. Помимо указанных выше клеток эпителия почки и эндотелия роль цилий в качестве механодетекторов описана для холангиоци-тов, хондроцитов и остеоцитов [76-79]. Так активация кальциевых каналов цилии хондроцитов приводила к усилению синтеза внеклеточного матрикса [77]. Для цилий остеоцитов была показана их роль в дифференцировке в остеогенном направлении и метаболизме кальция в зависимости от механической нагрузки [79]. Роль цилий как детекторов изменений в давлении потока жидкости была также показана для клеток эндотелия аорты мышей, нокаутных по генам PKD1 или Tg737, кодирующим полицистин-1 (PC1) или гомолог гена Chlamidomonas flagella IFT88 у человека и мыши соответственно [80]. Мутантные клетки не реагировали на изменения в давлении потока жидкости, в то время как в интактных клетках увеличивалось содержание Ca2+ и NO пропорционально силе воздействия, а также происходило распространение сигнала на соседние клетки. Полицистин-1, являющийся механодетектором, функционирует совместно с полицистином-2 - кальциевым каналом [81, 82]. Предполагается, что действие полицистина-1 не ограничивается локальным открыванием кальциевого канала, но также влияет на процессы регуляции дифференциальной активности генов через миграцию образовавшегося в результате протеолиза С-концевого хвоста (C-terminal tail, CTT) в ядро и активацию путей AP-1, Wnt, AP-1, mTOR, а также JAK-STAT [83-88]. Полицистины принадлежат к семейству каналов TRP (Transient receptor potential channels), включающими также TRPC1 и TRPV4 [89]. Эти каналы активируются не только изгибанием цилии, но также сжатием и растяжением [90]. В частности, для хондроцитов также показана возможность ответа на сжатие и изменение осмотических условий за счет TRPV4 каналов [76, 77]. Холангиоциты, имеющие мутацию в гене IFT88, в ответ на циклическое сжатие не изменяли экспрессии генов белков, участвующих в гомеостазе внеклеточного матрикса, включающих металлопротеиназы, гликоз-амингликонов и коллагена II в отличие от интактных клеток [79, 91]. По аналогичном механизму функционирует механосенсорная функция остеоцитов. Значительную роль в этом отводят p2-рецепторам и активируемой ими аденилатциклазе, опосредованно контролирующей внутриклеточную концентрацию кальция. Несмотря на то, что большая часть работ, исследующих механодетекторную функцию цилий сосредотачивается на исследовании процесса восприятия ими механического раздражения, не описывая при этом механизма активации необходимых генов, есть основания полагать, что происходит это опосредованно через сигнальные пути, среди которых Hh, Wnt, PDGF и другие [79]. Хемосенсорная функция цилий Химическая чувствительность цилий определяется восприятием растворимых молекул, запускающих внутриклеточные сигнальные пути. Её частным случаем является восприятие попадающих на слизистую оболочку полости носа веществ. Наиболее важной составляющей сигнальных путей, активируемых попадающими на рецепторы цилии лигандами, является активация генов, предопределяющих развитие клетки. Hedgehog (Hh) - один из наиболее исследованных сигнальных путей, связанных с цилиями и участвующий в развитии организма на эмбриональном этапе, поддержании гомеостаза клетки в зрелом организме, а также в регенерации и канцерогенезе [92]. Связывание лиганда из семейства Hh с рецептором PTCH1, расположенном на цилиарной мембране, приводит к активации другого цилиарного белка Smoothened (SMO), что останавливает протеолиз транскрипционных факторов GLI. Полноразмерная молекула GLI действует как транскрипционный активатор [92, 93] (рис. 4). Участники сигнального пути Hh в клетке локализованы в цилиарной мембране и цилиоплазме [94]. По-видимому, цилия, являясь изолированным клеточным компартмен-том, обеспечивает условия для защиты находящихся в ней сигнальных путей и сохранения относительно высокой скорости передачи сигнала за счет удержания их участников в непосредственной близости друг к другу. Кроме рецепторов Hh на мембране цилии присутствуют и другие представители сигнальных путей, чья связь с цилиями изучена в меньшей степени. К ним относятся Hippo, Notch, mTOR, PDGF [95]. Специализированные цилии Ряд клеток обладает высокоспециализированными первичными цилиями. К ним относятся волосковые Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 ОБЗОРЫ 25 Пролиферация клеток Дифференцировка Формирование плоскостной полярности клеток Ремоделирование тканей Функционирование клеток и тканй Рис. 4. Функции сенсорных цилий клетки вестибулярного лабиринта, улитки, фоторецепторные клетки и обонятельные клетки. На волосковых клетках расположены кино- и сте-реоцилии. Киноцилии структурно ближе к подвижным цилиям, однако ввиду отсутствия у них динеиновых ручек способностью к активному изгибанию не обладают. У человека они не участвуют в восприятии звука, однако функционируют как организаторы для стереоцилий, располагающихся в процессе дифферен-цировки волосковых клеток V-образно по отношению к киноцилиям [96-99]. В строгом смысле стереоцилии, располагающиеся помимо эпителиоцитов вестибулярного лабиринта и улитки на эпителиоцитах семявыносящего протока и протока придатка яичка, к цилиям не относятся [96, 97, 100]. Их внутреннее строение представлено параллельными пучками ß- и у-актиновых филаментов с поперечными связями, в то время как определяющие цилиарные структуры - БТ и аксонема - отсутствуют [98]. Фоторецепторы образованы внутренним и наружным сегментами. При этом наружный сегмент является высокоспециализированным производным цилии. Между сегментами расположено базальное тельце, дистальнее которого находится структура, аналогичная переходной зоне в сенсорных цилиях [101, 102]. Функционирование фоторецепторных цилий сходно с другими сенсорными цилиями: в ответ на ряд внутрирецепторных преобразований, вызванных попаданием света на наружный сегмент, происходит изменение пропускной способности ионных каналов, что в свою очередь, формирует потенциал действия [103-105]. Обонятельные клетки представляют собой биполярные нейроны, чьи цилии выходят на поверхность слизистой носа. На их мембранах находятся одорант-связывающие рецепторы, запускающие ряд реакций, вызывающих потенциал действия [106]. Отдельно следует указать роль цилий в формировании билатерально асимметрии. У млекопитающих цилии эмбрионального узелка, определяющие билатеральную асимметрию, расположены в эмбриональном узелке - структуре, располагающейся в ростральной части первичной полоски у мышиных эмбрионов (аналогично ген-зеновскому узелку у птиц] [107]. Как было указано выше, узелковые цилии по строению занимают промежуточное положение между подвижными и сенсорными, поскольку не имеют центральной пары микротрубочек, однако обладают динеиновыми ручками. Несмотря на это, они способны к ротационному движению по часовой стрелке при наблюдении сверху [1 08]. Однозначное понимание того, как узелковые цилии определяют билатеральную асимметрию, отсутствует, однако предполагают, что в этом задействован описанный выше механизм активации полицистинов, приводящий ко входу в клетку Ca2+. В отношении дальнейших событий окончательной ясности нет. Предполагают участие в них факторов BMP, FGF, сигнальных путей Shh, Wnt [109-111]. Цилиопатии Цилиопатии - постоянно увеличивающаяся и дополняющаяся группа наследственных заболеваний, вызванных мутациями в генах белков, определяющих структуру и функции цилий. В связи с широкой распространенностью цилий в организме человека цилиопатии затрагивают разные ткани и органы. На 2017 год сообщалось о по меньшей мере 35 нозологиях, связанных с повреждением цилий, 187 генах, участвующих в патогенезе цилиопатий и ещё 240 являющихся кандидатами [112]. Единого критерия, позволяющего классифицировать цилиопатии нет, а попытки их упорядочить приводят к нескольким подходам. Наиболее очевидное и удобное деление цилиопатий основывается на виде поражаемых цилий на подвижные и сенсорные [112, 113]. «Подвижные цилиопатии» Эта группа цилиопатий связана с нарушением подвижности цилий. В англоязычной литературе подвижные цилиопатии цилий часто обозначаются как первичная цилиарная дискинезия (primary ciliary dyskinesia, PCD], что позволяет отделить её от ситуаций, в которых неподвижность цилий вызвана воспалительным процессом в ткани. Более удачным, однако менее распространенными термином является «синдром неподвижных цилий» [114]. В основе синдрома неподвижных цилий нередко лежат нонсенс-мутации в генах моторных белков. Чаще всего это белки, входящие в состав наружных и внутренних динеиновых ручек [115]. Миссенс-мутации в генах белков радиальных спиц или генах мультицилиарного фенотипа, минорны в структуре зафиксированных случаев синдрома неподвижных цилий. Однако некоторые из миссенс-мутаций в генах радиальных спиц проявляются как нонсенс-мутации, приводя к потере функциональности всей белковой молекулы [116]. Другой причиной нарушения движения цилий являются дефекты цилиогенеза. Показана связь между мутациями в генах FOX и MCIDAS, экспрессирующихся на ранних этапах цилиогенеза в мультицилиарных клетках и клетках первичного узелка. Эти дефекты приводят к нарушениям миграции и расположения базальных телец образующихся цилий относительно плазматической мембраны [117-119]. Подвижные цилиопатии проявляются нарушениями в движении цереброспинальной жидкости, ухудшением Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 26 ОБЗОРЫ Укороченная и деформированная цилия Мутантный укороченный фиброцистин Нормальная форма цилии Фиброцистин Полость первичного желчного канальца Ca2+ Wnt Нарушение регуляции ремоделирования дуктальной пластинки Портальная Дуктальная пластинка Сформированные желчные канальцы Кистозно расширенные желчные канальцы Нормальная структура печени Расширенные внутрипеченочные желчные протоки и портальный фиброз Врожденный перипортальный фиброз Кисты желчных протоков Рис. 5. Схема патоморфогенеза синдрома Кароли вена мукоцилиарного транспорта и движения яйцеклеток по маточной трубе. Клинически это проявляется внутренней гидроцефалией, персистирующими бронхитами и синуситами, снижением фертильности, а также синдромом Картагенера - аномалиями расположения внутренних органов. Несмотря на неизвестность многих звеньев патогенеза этого синдрома, показана четкая связь между ним и нарушением движения узелковых цилий [119-122]. Сенсорные цилиопатии Сенсорные цилиопатии - чрезвычайно гетерогенная группа заболеваний, затрагивающих почти все системы организма. От подвижных цилиопатий их отличает большее разнообразие поражаемых цилиарных структур, проявляющееся множеством патологических состояний как на уровне отдельных клеток, так и на уровне систем органов. При этом патоморфологические проявления, а также клиническая симптоматика значительно варьируют по своим характеристикам и степени выраженности даже в пределах одной нозологии. Как отмечалось ранее, центральной функцией первичных цилий является участие в сигнальных путях, предопределяющих развитие клетки. В свете исследований последних десяти лет возрастает уверенность в наличии связи между развитием первичных цилиопатий с нарушением сигнальных путей, функционирующих в цилиях. Аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек (АДПБП) - это заболевание, встречающееся с частотой от 1 на 500 до 1 на 1000 человек и характеризующееся образованием в почках и иногда в печени и поджелудочной железе множества кист в большинстве случаев, приводящих к развитию почечной недостаточности. Для АДПБП центральная роль в патогенезе отводится полицистину-1. Помимо механодетекторной функции для полицистина-1 предполагается сигнальная, реализуемая через пути mTOR и JAK/STAT [123-125]. Ответом на активацию PKD1, по-видимому, является угнетение пролиферации в пользу дифференцировки. Экспрессия PKD1 в культуре MDCK замедляла пролиферацию клеток и предотвращала запрограммированную клеточную смерть. Также MDCK клетки демонстрировали способность к спонтанному формированию трубочек, в то время как контрольная группа образовывала простые кисты [126]. Критичным для формирования кист является отсутствие PKD1 на определенном этапе развития почек. При выключении PKD1 до 13 дня постнатального развития мышей приводило к быстрому формированию большого количества кист в течение нескольких недель. Выключение гена начиная с 14 дня сопровождалось лишь отдаленным по времени формированием кист [127]. При этом иммуногистохимический анализ экспрессии PCNA указывает на высокую пролиферативную активность клеток, образующих стенки кист [128]. Также небольшое увеличение пролиферации фиксировалось при выключении PKD1 шестинедельной мыши [127]. Другой моногенной цилиопатией является синдром Кароли, встречающийся с частотой 1 на 1 000000. В его основе лежат мутации в гене фиброцистина PKHD1, относящемуся к одному семейству с PKD. Фиброцистин - мембранный белок со свойствами механодетекции в печени и почках, а также связанный с сигнальным путем Wnt [129, 130]. Наиболее значимыми его функциями являются участие в ремоделировании дуктальной пластинки в печени и тубулогенезе в почках (рис. 5) [131-133]. Предполагается, что дефект в гене фиброцистина ведет к изменениям в балансе каноничного и неканоничного путях Wnt, что определяет нарушение плоскостной клеточной полярности - распределения клеток в двумерном пространстве [134]. Это обуславливает нарушение ремоделирования дуктальной пластинки в эмбриональном периоде развития внутрипеченочных желчных протоков, что приводит к их кистозному расширению, впоследствии способствующему развитию гнойного холангита, а также сопутствующего фиброза паренхимы печени и билиарного цирроза [135]. Внепеченочным проявлением синдрома Кароли является образование кист в почках [130, 135]. Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 ОБЗОРЫ 27 Рис. 6. Результаты патоморфологического исследования пациента с синдромом Кароли: A - макроскопический вид печени на вскрытии; Б - гистологический препарат печени, обширный фиброз (голубого цвета); В - расширенные синусоидные пространства, частичная дискомплексация балок; Г - СК7-положительные холангиоциты и гепатоциты; Д - диффузная реакция с антителами к каспазе-3; Е - реакция с антителами к PCNA; Ё - желчные камни в просвете желчных протоков; Ж - стенка кисты в печени, представленная грануляционной и фиброзной тканями; З - реакция с антителами к CD4; И - реакция с антителами к HLA-DR; К - реакция с антителами к ß-тубулину, отрицательный результат; Л - множественные микрокисты в почке. Окраска: Б - по Маллори; В, Ё, Ж, Л - гематоксилин и эозин; Г, Е, З-И - гематоксилин. Ув.: Б, Ё, З х100, В, Г-Ж, И, Л х200-250; К х400 Клинический случай синдрома Кароли Для демонстрации клинической значимости цилиопа-тий приводим собственное наблюдение случая синдрома Кароли [135]. Мужчина 37 лет поступил в гастроэнтерологическое отделение ГАУЗ МКДЦ (Казань) с жалобами на боль в животе, желтушность кожных покровов, тошноту, рвоту желудочным содержимым. Пациент с детства страдал циррозом печени неясной этиологии (функциональный класс B по Чайлд-Пью, MELD 43) с синдромом портальной гипертензии (варикозное расширения вен пищевода I ст.), калькулезным холециститом, рецидивирующим холангитом, в анамнезе эпизоды тромбозов воротной и селезеночной вен. На УЗИ гепатобилиарной системы были выявлены признаки выраженной гепато- и спленомегалии (косой вертикальный размер правой доли печени 21 7 мм, левой 123 мм, размеры селезенки 315x123 мм), холелитиаза, расширения общего желчного протока до 19 мм. Уровень общего билирубина в крови был повышен до 371,4 мкмоль/л за счет прямой фракции (234,5 мкмоль/л). КТ брюшной полости и забрюшинного пространства выявила множественные кисты в правой доле печени. За время пребывания пациента в стационаре были проведены 8 сеансов эндоскопической ретроградной хонангиопанкреатографии, повторная папиллосфинкте-ротомия с удалением мелких камней и замазкообразной желчи. Пациенту были проведены антибиотикотерапия (цефтриаксон, меропенем), инфузионно-детоксикаци-онная, гепатопротективная, диуретическая терапия, коррекция электролитного баланса, плазмаферез. С 10 дня госпитализации у пациента наблюдалось обильное выделения желчи по назобилиарному дренажу (2000-3500 мл/сут.), отрицательная динамика в виде развития отечно-асцитического синдрома, нарастания гипербилирубинемии до 1 1 08 мкмоль/л, развития печеночной энцефалопатии. Смерть пациента наступила на 29 день госпитализации. На аутопсии выявлена гепатомегалия (размеры печени 30x23x19x12 см, масса 3000 г), поверхность печени мелкобугристая, зелено-коричневого цвета, на разрезе цирротические узелки диаметром до 0,3 см, многокамерные кисты 0,5-7,5 см в диаметре, содержащие сгустки желчи и желтоватый гной (рис. 5). Также обнаружены спленомегалия (размеры селезенки 27x12x6 см, масса 2100 г), кардиомегалия, острое венозное полнокровие легких, варикозное расширение вен нижней трети пищевода. При патогистологическом исследовании выявлен билиарный цирроз (рис. 6), признаки дисплазии в виде утраты балочного строения паренхимы печени, гиперх-ромии и полиморфизма ядер гепатоцитов. В фиброзных полях обнаруживалось множество расширенных пролиферирующих желчных протоков разного размера, содержавшие желчные камни и гной. Гепатоциты экспрессировали цитокератин 7, что свидетельствует о нарушении их дифференцировки (в норме этот белок цитоскелета характерен для холангиоцитов). Наблюдалась диффузная экспрессия гепатоцитами каспазы-3 - маркера апоптоза. Окрашивание гиперплазированных холангиоци-тов к ß-тубулину выявило снижение его экспрессии по сравнению с контролем, что указывает на нарушение Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 28 ОБЗОРЫ структуры цилий холангиоцитов. Также было обнаружено множество гигантских кист, выстланных одним слоем холангиоцитов и содержащих в просвете желчь и гной. Отмечена инфильтрация желчных протоков и окружающей соединительной ткани CD4+ лимфоцитами, что может быть связано с экспрессией холангиоцитами HLA-DR, в норме не наблюдаемой. В почках была констатирована атрофия и десквама-ция эпителия собирательных трубочек с формированием микрокист. Материалом для генетического анализа - полноэкзомного секвенирования нового поколения* послужили * Выполнено в Центре генетики и репродуктивной медицины «ГЕНЕТИКО», Москва. ткани печени, забранные в ходе аутопсии. Генетическое исследование выявило у пациента две компаунд-гетерозиготные мутации в гене PKHD1, приведшие к заменам с менее полярной на более полярную аминокислоту (p.Tyr1136Cys и p.Arg1369Cys) во внеклеточных доменах фиброцистина, а также предположительно изменяющие активность экзонного энхансера сплайсинга. Таким образом, патоморфогенез синдрома Кароли характеризуется выраженной пролиферацией холанги-оцитов и тканевой дисплазией вследствие изменений в строении и функционировании сенсорных цилий. Низкодифференцированные холангиоциты, предположительно, стали причиной воспалительных и фиброзных изменений в ткани печени. Описанные примеры указывают на вовлеченность в патогенез цилиопатий проходящих через цилии сигнальных путей, предопределяющих развитие клетки и, в дальнейшем, ткани. Помимо этого, наличие микрокист в почке как внепеченочное проявление мутации гена фиброцистина позволяет говорить о цилиопатиях не как о дискретных, но в большей степени как о континуальных заболеваниях, приводящих при поражении одной структуры к разным проявлениям, зависящим от значимости поврежденного сигнального пути для клетки на разных этапах её существования. Клинические проявления первичных цилиопатий также значительно варьируют по выраженности влияния на прогноз жизни от сравнительно мягких проявлений до множественных пороков развития, не совместимых с жизнью. Более сложными и менее изученными примерами первичных цилиопатий, иллюстрирующих вышесказанное, являются синдромы Барде-Бидля и Мекеля-Грубера. В первом случае развитие заболевания связано с группой генов, кодирующих белки BBS с частотой 1 на 150000. На сегодняшний день известен по меньшей мере 21 белок из группы BBS, а также ряд других белков, включающий CEP290, MKS1, NPHP и ALMS1 [136, 137]. Основными функциями белков BBS являются участие в цитокинезе и цилиогенезе, а также формирование транспортируемых посредством ИФТ везикул совместно с белками группы IFT [138-140]. Также имеются данные, указывающие на участие BBS в транспорте внутриклеточных везикул вне пределов цилии [141]. Клинически синдром Барде-Бидля проявляется дистрофией фоторецепторного слоя, ожирением, поли- и брахидактилией, гипогонадизмом, нарушением почечной функции, а также снижением интеллекта и рядом минорных проявлений [142]. Наблюдается статистическая зависимость вероятности появления определенных клинических проявлений при поражении некоторых генов из группы BBS, однако исследования, детально рассматривающие молекулярный патогенез синдрома Барде-Бидля, отсутствуют [141]. Несмотря на это, можно предположить, что формирующиеся проявления связаны с нарушением сигнальных функций цилий [143, 144]. Другим заболеванием, обусловленное мутациями во множестве генов, является синдром Мекеля-Грубера, характеризующийся множественными пороками развития и встречающийся с частотой от 1 на 13 250 до 1 на 140000. Наиболее часто заболевание характеризуется триадой: затылочное энцефалоцеле, поликистоз почек и полидактилия. В большинстве случаев заболевание приводит к внутриутробной гибели плода. В основе синдрома лежат мутации в четырнадцати разных генах, чьи белки участвуют в формировании переходной зоны. Необходимо отметить, что для большей их части имеет место алле-лизм с синдромом Барде-Бидля, синдромом Жубера -цилиопатией, характеризующейся гипо- или аплазией червя мозжечка, олигофренией, атаксией, колобомой и фиброзом печени, а также нефронофтизом, для которого характерно наличие кист в корковом и медуллярном слоях и интерстициальный фиброз почки [145]. Иногда возможно формирование нескольких из описанных заболеваний в пределах одной семьи [145, 146]. Предполагается, что молекулярный механизм синдрома Мекеля-Грубера связан с дефектами переходной зоны цилии. Небезосновательно предположить, что дефекты переходной зоны, определяющие изоляцию цилиоплазмы, изменяют функционирование интрацили-арных сигнальных путей, приводя к нарушениям в пролиферации идифференцировке клеток. Экспериментальным подтверждением этому является обнаруженная связь между мутациями в генах белков, входящих в состав переходной зоны и нарушением работы сигнального пути Hedgehog на мышиных моделях [147, 148]. Связь цилиопатий с онкогенезом Роль в онкогенезе показана для сигнальных путей Hh, Notch, Wnt, PDGF и MARK/ERK [149, 150]. При этом необходимо отметить, что эта роль двойственна и может как способствовать опухолевой прогрессии, так и замедлять её [151]. Несколько исследований, изучавших связь цилий с патологическими состояниями при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы, показали возможность как наличия, так и отсутствия цилий на раковых клетках [152-154]. В одном из них указывалось на связь между наличием цилий с худшим прогнозом и большей вероятностью метастазирования в лимфоузлы [152]. При этом неясно, что является причинным фактором, а что следствием: потеря цилий и, как следствие, прогрессия опухоли или утрата цилии является результатом далеко зашедшего нарушения дифференцировки. Существуют исследования, указывающие на то, что правильнее говорить не об исчезновении цилий с поверхности раковых клеток, а об их перераспределении на клетки стромы [153]. В других ситуациях, как например при медуллобластоме и базальной-клеточной карциноме, опухолевые клетки, наоборот, сохраняют цилии, в которых активируется Hh [151]. Предполагается, что активация или, наоборот, замедление роста опухоли зависит от того, какие гены мутантных белков сигнального пути Hh будут активированы: для медуллобластомы и базальноклеточной карциномы характерна опухолевая индукция при мутации в гене Smo и ингибирование онкогенеза при активации Gli2 [97, 151]. Гены & Клетки, том XV, № 2, 2020 ОБЗОРЫ 29 Помимо непосредственно опухолевых клеток, цилии вовлечены в регуляцию клеток опухолевого микроокружения [155]. Так, повышенная секреция Shh клетками аденокарциномы поджелудочной железы линии Capan-2 приводила к активации звездчатых клеток поджелудочной железы и активации десмопластической реакции [156]. Подходы к диагностике цилиопатий Диагностика цилиопатий во многом зависит от конкретной нозологии и имеющихся на момент обследования симптомов. На этапе клинического обследования возможно классифицировать патологию как один из описанных выше синдромов, однако для более точной характеристики заболевания и его варианта необходимо генетическое тестирование [157]. С практической стороны оно позволит прогнозировать течение заболевания и начать раннюю профилактику осложнений, а также при необходимости осуществлять семейное консультирование и последующий патронаж семей с наследуемыми мутациями. При секвенировании некоторые авторы рекомендуют отдать предпочтение панелям целевых генов перед полногеномными методами секвенирования как более эффективным и низкозатратным. С другой стороны, такой подход ограничен скринингом уже известных генов и для обнаружения новых мутаций в ранее неизвестных генах необходимо полногеномное секвенирование. Также это позволяет обнаружить мутации сразу в нескольких генах, что важно при полигенных цилиопатиях [158]. Потенциальные пути коррекции цилиопатий Многообещающим потенциальным путем лечения генетических заболеваний является генная терапия [159]. Однако в случае цилиопатий существует ряд препятствий на пути создания препарата, способного к клинически значимой коррекции. Одной из основных проблем является формирование множественных поражений разных органов и систем пренатально, что значительно усложняет их диагностику и последующее лечение. Существует ряд технических трудностей, связанных с доставкой терапевтической конструкции в разные органы, а также необходимость её интеграции в геном клетки, поскольку формирование исправленных цилий возможно только после деления клеток. Несмотря на описанные выше сложности, возможно создать условия для лечения некоторых проявлений цилиопатий в уже дифференцированных тканях. Описана попытка лечения аносмии у мышей, вызванной дефектами цилий обонятельных нейронов, в основе которых находится мутация в гене IFT88. Интраназальная аденовирусная доставка гена IFT88 привела к появлению морфологически нормальных цилий, имеющих функциональный белок IFT88 и способных к восприятию запахов, что было подтверждено в тестах электроольфактографией [160]. Наиболее вдохновляющим опытом успешного лечения цилиопатий является начавшийся эксперимент по лечению амавроза Лебера с использованием CRISPR/Cas9 технологии для исправления мутантного гена CEP290 [161]. Несмотря на то, что результаты исследования ещё не получены, оно показывает принципиальную возможность лечения цилиопатий у человека. Таким образом, наиболее перспективным является лечение моногенных цилиопатий, с ограниченным количеством поражаемых органов в максимально ранние сроки. Несмотря на то, что основные процессы формирования органов и связанных с ними дефектов при цилиопатиях приходится на эмбриональный этап развития, есть основания полагать, что определенный вклад в развитие фенотипа цилиопатии вносят процессы, происходящие постнатально [162], поэтому разработка различных вариантов генной терапии или редактирования генома все же может оказаться перспективной. Заключение Цилии - органеллы, главной функцией которых является создание привилегированного компартмента клетки, специализирующегося на восприятии и передаче сигналов молекулярных внутрь. Это определяет ключевые для клетки события, включающие пролиферацию, дифференцировку, плоскостную клеточную полярность и запрограммированную клеточную гибель, что, в свою очередь, определяет гистогенез и дальнейшее функционирование тканей. На сегодняшний день исследованы фундаментальные механизмы реакции цилий на внешние стимулы, однако дальнейшая передача сигнала в клетку и ответные изменения в её поведении требует более подробного изучения. Другим важным направлением исследований является аннотация мутаций в генах цилий и описание их связей с фенотипом заболевания. Это позволит лучше понять как функции элементов цилии, так и закономерности развития разных вариантов цилиопатий. А выявление поражения ключевых цилиарных генов определит дальнейшие направления поисков мишеней для генной терапии.

About the authors

F. A Indeykin

Kazan State Medical University

Email: f.indeickin@yandex.ru
Kazan, Russia

M. O Mavlikeev

Kazan (Volga region) Federal University

Kazan, Russia

R. V Deev

I.I. Mechnikov North-West State Medical University; Human Stem Cell Institute

Saint Petersburg, Russia; Moscow, Russia

References

Supplementary files