Tay-Sachs disease: diagnostic, modeling and treatment approaches

Texto integral

GM2-ганглиозидоз представляет собой группу аутосомно-рецессивных заболеваний нарушения обмена веществ, относящуюся к лизосомным болезням накопления. Данные заболевания обусловлены дефицитом гидролитического фермента р-гексозаминидазы (hexosaminidase, Hex), отвечающего за деградацию GM2-ганглиозидов, которые для фермента Hex являются субстратом. Ганглиозиды в наибольшей концентрации представлены в нервной ткани, особенно в головном мозге, главным образом в терминальных аксонах и синаптических окончаниях нейронов, и являются основными гликолипидами нейрональных мембран [1, 2]. Ганглиозиды играют важную роль в функционировании ионного канала и рецепторной сигнализации, обеспечивают нормальное развитие нервной ткани и формирование нейропластичности. Аномальное накопление ганглиозидов приводит к прогрессирующей дисфункции центральной нервной системы (ЦНС) [3]. У р-гексозаминидазы существует два основных изофермента: HexA, состоящий из двух субъединиц - а и р, являющихся продуктами экспрессии генов HEXA и HEXB, соответственно, и HexB - гомодимер, состоящий из двух р-субъединиц [4, 5]. Две субъединицы фермента HexA (а и р) синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПр), где происходит их гликозилирование, образование дисульфидных связей и димеризация. Образование изоферментов обусловлено значительным структурным сходством между а и р субъединицами [5]. После диме-ризации субъединиц в ЭПр HexA транспортируется Для нормального функционирования фермента HexA необходимо присутствие белка-активатора GM2A, который выступает в качестве кофактора и превращает липофильный GM2-ганглиозид в форму, доступную для гидролиза в гидрофильной среде лизосомы [7] (рис. 1). GM2-ганглиозидоз развивается в результате мутаций в трех генах-HEXA (15 хромосома), HEXB (5 хромосома), GM2A (5 хромосома) и включает несколько заболеваний: (I) болезнь Тея-Сакса (бТС, OMIM 272800), при которой мутации в гене HEXA приводят к нарушению активности только HexA (вариант В); (II) болезнь Сандхоффа (OMIM 268800), обусловленную мутациями в гене HEXB с нарушением активности HexA и HexB (вариант О), и (III) дефицит белка-активатора GM2 (OMIM 272750) вследствие мутации в гене Gm2a (вариант АВ) [8]. Болезнь тея-Оакса При бТС, обусловленной дефицитом фермента HexA, GM2-ганглиозиды накапливаются внутри лизосом, которые образуют в нейронах мембранные цитоплазматические тельца, представляющие собой сильно растянутые лизосомы, заполненные ганглиози-дами [4] (см. рис. 1). Накопление ганглиозидов приводит к деструкции мембран нейронов, вследствие чего у пациентов возникает задержка моторного развития, нарушается психическое и физическое развитие. Ганглиозиды также накапливаются в клетках печени и селезенке [9]. При БТС наблюдаются пролиферация (экспансия) активированной микроглии и накопление сложных липидов в макрофагах [10], отмечается активация макрофагов и астроцитов с образованием воспалительных медиаторов [11]. Такой воспалительный ответ возникает до проявления клинических признаков заболевания и может усугублять неврологические нарушения [12]. Сходный процесс развивается в нейронах мозжечка, базальных ганглиев, ствола головного мозга, спинного мозга, спинальных ганглиев, а также в нейронах вегетативной нервной системы [5]. Рис. 1. Метаболизм 0М2-ганглиозидов в норме и при болезни Тея-Сакса По данным OMIM БТС наиболее часто встречается (1:3,6 тыс. новорожденных) у евреев Восточной и Центральной Европы (ашкеназов). Частота носителей в вышеописанной популяции 1 :30. В общей популяции частота встречаемости БТС 1:320 тыс. новорожденных (частота носителей 1:250) (https://omim.org/ clinicalSynopsis/272800). Описано более 130 различных мутаций гена HEXA (частичная делеция, мутации при сплайсинге, нонсенс мутации, миссенс мутации), которые приводят к нарушению транскрипции, трансляции, фолдинга, димеризации мономеров и каталитической функции HexA [13]. Г етерогенность БТС в отношении тяжести проявления клинических признаков и возраста начала заболевания обусловлена наличием остаточной активности HexA, зависящей от типа (вида) мутации [14]. Известно, что для предотвращения накопления GM2-ганглиозидов требуется только 10-15% активности HexA [15]. БТС имеет три формы, отличающиеся возрастом больного, когда начинают проявляться первые признаки заболевания, и тяжестью клинических признаков [16]. Инфантильная форма БТС развивается в младенческом возрасте с быстрым прогрессированием задержки психомоторного развития и ассоциируется с очень низкой активностью HexA (<0,5%). При самой тяжелой инфантильной форме симптомы проявляются через несколько месяцев после рождения [17, 18]. Наиболее часто встречающимися нейродегенеративными признаками данной формы являются мышечная гипотония, неспособность самостоятельно сидеть и держать голову, непроизвольные движения глаз, дисфагия, судороги, диффузная гипомиелинизация белого вещества головного мозга и др. [19]. Большинство пациентов с инфантильной формой БТС не доживают до 4 лет [20]. Клиническая манифестация при ювенильной (подо-строй) форме БТС в среднем приходится на возраст 3-5 лет. В юношеском возрасте заболевание проходит в менее тяжелой форме, чем в младенческом возрасте, но имеет более широкий спектр симптомов [21]. Распространенными симптомами являются атаксия, дизартрия, дисфагия, мышечная гипотония и судороги, а также слабость в мышцах конечностей, нарушение и шаткость походки, которая наблюдается у 88% пациентов [22]. Смерть наступает обычно в возрасте до 15 лет от сопутствующих заболеваний, пневмонии или других инфекций, протекающих у пациентов с БТС в тяжелой форме [18]. Форма заболевания бТС с поздней клинической манифестацией (обычно в возрасте 20 лет и позже) является менее агрессивной и характеризуется более высокой остаточной активностью HexA, составляющей 5-20% от активности фермента в норме [23], что приводит к более медленному прогрессированию нейродегенерации и снижению психомоторного развития [15, 24]. БТС с поздней клинической манифестацией отличается высокой клинической вариабельностью, а продолжительность жизни пациентов сильно варьирует в зависимости от тяжести течения заболевания [1]. Известно, что продолжительность жизни самого пожилого пациента с БТС составила 76 лет [2]. Диагностика болезни Тея-Сакса Явным диагностическим признаком у пациентов с БТС является наличие «вишневого» пятна макулы на сетчатке глаза. Г англиозные клетки сетчатки набухают и содержат 8М2-ганглиозиды, что видно, в частности, по краям желтого пятна [5]. В результате в зоне желтого пятна появляется «вишневое» пятно, подчеркивающее нормальный цвет сосудистой оболочки глаза, который контрастирует с бледностью набухших ганглиозных клеток в пораженной части сетчатки [4]. Важный метод диагностики БТС - энзимо-диагностика для оценки ферментативной активности HexA в плазме с использованием синтетических субстратов: 4-метилумбеллиферил-6!сМАс (англ. 4-methylumbelliferone-GlcNAc, 4MUG) и 4-метилумбеллиферил^^Ас-6-сульфата (англ. 4-methylumbelliferyl-GlcNAc-6-sulfate, 4MUGS) [25]. В норме активность общей Hex составляет 5231865 нмоль/мл/ч., из которой доля фракции HexA - 30,9-72,0% [7]. Одним из наиболее достоверных диагностических методов является скрининг мутаций гена HEXA с помощью анализа первичной нуклеотидной последовательности геномной ДНК (секвенирование). Более детальное описание ферментативного и молекулярно-генетических тестов дано в обзоре J. Zhang с соавт. (2019) [26]. Для беременных с высоким риском рождения ребенка с БТС (например, при наличии в семье носителя мутантого гена HEXA) может быть предложена пренатальная диагностика с применением вышеописанных тестов: для получения эмбриональных клеток проводят отбор ворсин хориона на 10-12 неделях или амниоцентез на 15-18 неделях беременности [25, 26]. Моделирование болезни Тея-Сакса Моделирование БТС проводят на мышах и овцах. Первые мыши с моделью БТС были получены в 1995 г. путем нокаута гена HEXA. У мышей с нокаутом гена HEXA отсутствовала активность HexA, однако накопление GM2-ганглиозидов и образование мембранных цитоплазматических телец в нейронах происходило только в некоторых областях головного мозга, исключая обонятельную луковицу, кору головного мозга и передние рога головного мозга. Мыши с нокаутом гена HEXA не проявляли клинических признаков БТС и имели нормальную продолжительность жизни [27]. Разница в накоплении ганглиозидов была обусловлена различием метаболизма между человеком и мышью: у мышей присутствуют одна или несколько сиалидаз, удаляющих сиаловую кислоту из GM2-ганглиозида, который впоследствии может гидролизоваться ферментом HexB у HEXA-дефицитных мышей [28, 29]. Важно отметить, что у HEXB-дефицитных мышей с моделью болезни Сандхоффа, в отличие от HEXA-дефицитных мышей, развивались нейродегенеративные поражения ЦНС со спастичностью, мышечной слабостью, ригидностью, тремором и атаксией [30, 31]. Таким образом, линия HEXB-дефицитных мышей может быть полезна для первоначальной оценки потенциальных методов лечения GM2-ганглиозидоза. Одним из наиболее подходящих объектов со спонтанно развивающейся БТС являются овцы Якоба, у которых клинические проявления БТС максимально схожи с таковыми у человека [32]. Овцы с БТС страдают атаксией, кортикальной слепотой и нарушением про-приоцептивной регуляции движения [33]. Генетические исследования показали, что дефицит активности HexA у овец с БТС связан с однонуклеотидной заменой в 11 экзоне гена HEXA, что приводит к замене глицина на аргинин [32]. Методы лечения болезни Тея-Сакса Основу симптоматического лечения БТС составляют противовоспалительные и противосудорожные препараты для замедления прогрессирования заболевания [34]. В настоящее время исследуется эффективность новых методов лечения БТС: субстрат-редуцирующая терапия (СРТ) [35], трансплантация костного мозга (ТКМ) [36] или пуповинной крови [37] и восстановление экспрессии функционального фермента HexA с помощью генной терапии [25]. Субстрат-редуцирующая терапия. Субстрат-редуцирующая терапия подразумевает использование небольших молекул иминосахара для замедления скорости биосинтеза гликолипидов [38]. Показана эффективность миглустата (N-бутилдиоксиноиримицина) для предотвращения накопления GM2-ганглиозидов [35, 39]. который действует как конкурентный ингибитор глюкозирцерамидсинтазы, фермента, катализирущего первый этап синтеза гликосфинголипидов, и может проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [40]. При клиническом применении миглустата у 2 пациентов с инфантильной формой БТС наблюдалась значительная концентрация миглустата в спинномозговой жидкости. Использование СРТ не привело к остановке неврологического ухудшения у пациентов: прогрессировали мишечная гипотония и задержка психомоторного развития. Через 9-12 мес. после проведения СРТ у обоих пациентов возникла миоклоническая эпилепсия и выявилась диффузная миелинизация. Также у одного из пациентов появились признаки кортикальной атрофии. Таким образом, была показана низкая эффективность СРТ для предотвращения нейродегенерации в ЦНС при БТС, однако прием миглустата был рекомендован для профилактики макроцефалии [35]. Аналогичные результаты были описаны в клиническом исследовании на 5 пациентах с ювенильной формой БТС. После СРТ с применением миглустата у всех пациентов в течение последующих 30 мес. отмечалось прогрессирование задержки психомоторного развития и нейродегенерации в ЦНС [39]. Заместительная терапия. Заместительная терапия (или терапия очищенными белками) является перспективным методом лечения ряда лизосомных болезней накопления и уже одобрена для клинического применения при болезни Гоше [41, 42], болезни Фабри [43], болезни Помпе [44] и мукополисахаридозе I, II и VI типов [45-47]. Однако при БТС заместительная терапия не получила широкого клинического применения, что обусловлено трудностями в преодолении ГЭБ молекулами фермента HexA при внутривенном введении [48, 49] и необходимостью синтезировать обе субъединицы фермента HexA [50]. Трансплантация костного мозга и пуповинной крови. Трансплантация костного мозга (ТКМ) применяется для лечения пациентов с различными лизосомными болезнями накопления и обеспечивает миграцию метаболически компетентных гемопоэтических клеток в пораженные заболеванием ткани, что может привести к восполнению дефицита ферментов [5]. В работе J. Jacobs с соавт. (2005) описан клинический случай применения ТКМ с последующей СрТ для лечения пациента с ювенильной формой БТС [36]. Непосредственно после ТКМ у пациента наблюдалось повышение ферментативной активности HexA в лейкоцитах до нормальных значений и незначительное увеличение ферментативной активности в плазме. Через 3 мес. после ТКМ ферментативная активность HexA снизились и стабилизировалась на уровне ниже нормальных значений, что указывало на смешанный химеризм. В дальнейшем у пациента продолжала прогрессировать задержка психомоторного развития и нейродегенерация в ЦНС. Применение миглустата через 23 мес. после ТКМ также не предотвратило усугубление неврологических нарушений [36]. В работе K. Stepien (2018) описан случай ТКМ от HLA-идентичного сиблинга 15-летнему пациенту с БТС с поздней клинической манифестацией [37]. Через 8 лет после ТКМ сохранилось полное приживление трансплантата, активность HexA в лейкоцитах пациента с БТС была сопоставима с активностью фермента в лейкоцитах здоровых доноров контрольной группы и составила 187 нмоль/мг/ч. Активность HexA в плазме была в три раза меньше нижнего предела активности HexA в норме (50-250 нмоль/мг/ч.) и равнялась 15 нмоль/мг/ч. Также было отмечено отсутствие прогрессирования интенционного тремора после ТКМ [37]. В качестве альтернативного подхода лечения пациентов, у которых нет подходящего донора костного мозга, рассматривается трансплантация пуповинной крови, полученной от частично HLA-идентичных неродственных доноров [51]. Пуповинная кровь человека является важным источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и клеток-предшественниц, способных оказывать нейропротекторное действие при дегенеративных процессах [52]. Безопасность трансплантации пуповинной крови была показана в клиническом исследовании у 69 пациентов с лизосомными болезнями накопления, в том числе у 3 пациентов с БТС, и перокси-сомными болезнями накопления. Однако не приведены данные об эффективности трансплантации пуповинной крови, которую необходимо подтвердить в дальнейших исследованиях [51]. Генная терапия. Попытки коррекции мутаций гена HEXA при помощи генной терапии начались еще в середине 1990 гг. Первыми векторами для доставки гена HEXA дикого типа стали аденовирусы. Исследования in vivo с использованием нокаутных по гену HEXA мышей показали, что при совместном внутривенном введении аденовирусные векторы, кодирующие гены HEXA и HEXB, преимущественно трансдуцировали клетки печени. Доставка генов HEXA и HEXB способствовала восстановлению ферментативной активности HexA в сыворотке крови и периферических тканях [53]. Основная проблема генной терапии БТС - выбор вектора и способа доставки терапевтических генов, позволяющих преодолеть ГЭБ и имеющих минимальное количество побочных эффектов. Главным ограничивающим фактором для успешного применения аденовирусных векторов при терапии заболеваний ЦНС является невозможность преодоления ГЭБ. Кроме этого, иммуногенность аденовирусных векторов и их тропизм к клеткам печени могут привести к накоплению вектора и сверхэкспрессии трансгена в данном органе, что может провоцировать развитие гепатоцеллюлярной опухоли [54]. Перспективным вектором для доставки целевых генов может стать репликационно-дефектный вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1), который способен инфицировать различные типы неделящихся клеток, в том числе нейроны, а также переноситься ретроградным способом к моторным и(или) сенсорным нейронам после инокуляции [55]. Было обнаружено, что введение ВПГ-1, кодирующего ген HEXA, во внутреннюю капсулу левого полушария головного мозга мышам с моделью БТС привело к восстановлению ферментативной активности HexA и полному удалению накоплений GM2-ганглиозидов, как в инъецированном, так и в контрольном (правом) полушариях головного мозга, а также в мозжечке и спинном мозге экспериментальных животных в течение 1 мес. после инъекции [56]. Большие успехи были достигнуты в разработке подходов для генной терапии GM2-ганглиозидозов с использованием векторов на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ). Было показано, что при внутричерепном введении рекомбинантных ААВ серотипов 2/1 или 2/2, кодирующих гены HEXA и HEXB, мышам с моделью болезни Сандхоффа повышался уровень экзогенного HexA во всех отделах ЦНС без явной цитотоксичности, связанной с использованием ААВ, и увеличивалась выживаемость подопытных мышей [25, 57]. Однако векторы на основе ААВ имеют ограниченную емкость (от 2,1 до 4,5 т. п. н.) и не могут нести сразу два гена, HEXA и HEXB, а эффективность котрансдукции значительно меньше, чем трансдукция одной конструкцией. Поскольку для эффективного восстановления секреции отсутствующего гетеродимерного изофермента HexA нужна экспрессия обеих субъединиц, а и р [50], был сконструирован самокомплементарный вектор на основе ААВ (вариант 9.47), кодирующий гибридную |j субъединицу (ААВ9.47-HEXM), содержащую специфические последовательности как а, так и р субъединиц, необходимые для функционального взаимодействия с комплексом GM2A-GM2-ганглиозида. Было показано, что внутричерепное введение ААВ9.47-HEXM снижало накопление GM2-ганглиозидов в головном мозге мышей с моделью БТС [50]. При внутривенном введении ААВ9.47-HEXM новорожденным мышам с моделью БТС также отмечалось снижение накопления GM2-ганглиозидов во всех отделах ЦНС [58]. На модели новорожденных мышей с моделью болезни Сандхоффа было обнаружено, что внутривенное введение ААВ9.47-HEXM приводило к эффективной трансдукции клеток ЦНС и увеличивало выживаемость мышей в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой [59]. При изучении терапевтической эффективности генной терапии с использованием вектора на основе ААВ 8 серотипа (ААВ8) овцам породы Якоба с БТС в возрасте 2-4 мес. делали внутричерепные инъекции ААВ8-HEXA (группа 1) или ААВ8-HEXA+ААВ8-HEXB (группа 2). Во всех исследуемых группах после инъекции терапевтических векторов на основе ААВ8 отмечалась задержка проявления симптомов заболевания. В группе 2 (при инъецировании овец комбинированным препаратом AAB8-HEXA+AAB8-HEXB) уровень HexA в головном мозге овец повышался в отличие от такового в группе 1 . Однако во всех группах наблюдалось лишь незначительное повышение уровня рекомбинантного HexA в спинном мозге овец и отмечалось снижение активации и пролиферации микроглии в головном мозге овец [60]. Полученные авторами данные подтвердились в исследовании, проведенном на кошках (на модели болезни Сандхоффа): была доказана безопасность метода и повышение уровня Hex в головном мозге животных после внутричепной инфузии вектора на основе ААВ8, кодирующего видоспецифичные гены HEXA и HEXB [61]. Безопасность применения векторов на основе ААВ8, кодирующих видоспецифичные гены HEXA и HEXB, была проанализирована в экспериментах на нормальных киномолгусских макаках. У большинства обезьян при внутричерепной инфузии ААВ8 развивались дис-кинезия, атаксия и потеря ловкости. Животные, получившие высокую дозу ААВ8, в конечном итоге стали апатичными. Гистологический анализ выявил наличие некроза белого и серого вещества вдоль инъекционной дорожки, реактивную сосудистую сеть и присутствие нейронов с гранулированным эозинофильным материалом. Несмотря на нейротоксичность, в таламусе отмечалось значительное увеличение активности Hex [62]. Авторы предположили, что тяжелая нейротоксичность может быть связана со сверхэкспрессией Hex. Заключение Для достижения терапевтического эффекта при лечении БТС необходимо увеличение уровня фермента HexA во всех отделах ЦНС. Субстрат-редуцирующая терапия, трансплантация костного мозга и пуповинной крови оказались недостаточно эффективными для предотвращения нейродегенерации в ЦНС, хотя данные методы позволяют частично восстановить активность HexA и уменьшить накопление GM2-ганглиозидов. На стадии разработки находятся методы генной терапии БТС с использованием вирусных векторов для доставки

Sobre autores

V. Solovyeva

Kazan (Volga region) Federal University

A. Shaimardanova

Kazan (Volga region) Federal University

D. Chulpanova

Kazan (Volga region) Federal University

K. Kitaeva

Kazan (Volga region) Federal University

A. Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

Email: rizvanov@gmail.com

Bibliografia

Arquivos suplementares