Pathological changes of myocardium in the model of chronic renal insufficiency at application of low-protein diet

Full Text

Осложнения со стороны сердечно-сосудистой системы являются причиной смерти у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) в 10-20 раз чаще, чем у пацеинтов с отсутствием заболеваний почек [1]. У 33% пациентов к моменту начала гемодиализной терапии уже имеются клинические проявления хронической сердечной недостаточности (ХСН) [2]. Гипертрофия миокарда левого желудочка (ГЛЖ) определяется у 75% пациентов с терминальной стадией ХПН [3]. Таким образом, миокард является одним из основных органов-мишеней у больных ХПН, что определяет необходимость разработки средств коррекци механизмов патогенеза этого состояния. Одним из компонентов комплексной терапии пациентов с ХПН является малобелковая диета, которая предполагает питание с пониженным уровнем животного белка. Этот подход препятствует развитию белокобусловленной Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 62 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ гломерулярной гипертрофии и гиперфильтрации, что способствует сохранению функции почек [5]. Также в отдельных работах было показано, что ограничение потребления белка обеспечивает снижение обратного захвата фосфора и снижению его концентрации в сыворотке крови [6]. Этот аспект патогенеза ХБП оставался без должного внимания на протяжении длительного времени и лишь в течение последних 10 лет появляются подтверждения значительной роли нарушения обмена фосфора в прогрессировании почечной недостаточности [7]. Учитывая широкую распространённость и клиническую значимость поражения миокарда у пациентов с ХПН, представляет интерес оценка влияния малобелковой диеты на его структурные изменения у этой категории пациентов. Целью настоящей работы было выполнение сравнительного гистологического исследования изменений миокарда на фоне применения малобелковой диеты. В качестве экспериментальной модели хронической почечной недостаточности была использована резекция 5/6 массы почечной ткани у крыс породы вистар. Материал и методы Экспериментальное исследование было выполнено на белых самцах крыс породы вистар массой 190220 г (n=23) с соблюдением международных правил гумманного обращения с лабораторными животными. Крысы были распределены на 4 группы (табл. 1). Экспериментальная модель ХПН Для воспроизведения ХПН в эксперименте была использована стандартизованная модель резекции 5/6 массы почечной ткани у крыс породы вистар. Операция выполнялась в два этапа с интервалом в 1 неделю - в ходе первого этапа осуществлялась резекция 2/3 почки слева, на втором этапе выполнялась нефрэктомия справа. Выведение животных из эксперимента осуществлялось через 4 месяца после операции. Для оценки степени выраженности нарушения функции почек на сроках 2 и 4 месяца выполнялась оценка концентрации в сыворотке крови мочевины, креатинина, кальция и фосфора. Послеоперационная выживаемость животных в эксперименте составила 94%. Пищевые рационы крыс В эксперименте были использованы два рациона: стандартный рацион (производитель «Информкорм», Россия) и малобелковая диета (МБД) - препарат Кетостерил («Фрезениус Каби», Германия; 1,5 г/100 г массы животного) и растительный продукт (крупа перловая) в соотношении 1:10. Препарат Кетостерил в своем составе содержит аминокислоты валин, лейцин, изолейцин и фенилаланин в форме кето-кислот, которые трансаминируются в организме в соответствующие L-аминокислоты, при этом осуществляется расщепление мочевины, что способствует снижению концентрации азота в сыворотке крови. Патогистологическое исследование Объектом морфологического исследования являлись фрагменты стенки левого желудочка. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обрабатывали по стандартной методике и изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. Проводилось иммуногистохимическое исследование миокарда для выявления капилляров микроциркуляторного русла с антителами к CD31 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1 - PECAM-1 (M-20), Santa Cruz, США). Для количественной характеристики патогистологических изменений были использованы морфометрические параметры, которые представлены в таблице 2. Неинвазивные экспериментальные процедуры В предшествующие сутки до оперативного вмешательства еженедельно и накануне выведения животных из эксперимента у бодрствующих животных производилось измерение АД методом наложения манжеты, оборудованной электроманометром ENEMA (Швеция), на хвост животного. Статистический анализ При анализе полученных данных были приняты во внимание объёмы изучаемых выборок, количество групп исследования, соответствие распределения признака в каждой изучаемой группе закону нормального распределения. Соответствие исследуемых данных закону нормального распределения при помощи критерия Шапиро-Уилка. С целью определения существенных различий между средними значениями различных совокупностей сопоставимых групп были использованы методы вариационного статистического анализа с применением t-критерия Стьюдента. Данные считали достоверными при р <0,05. Результаты Патогистологические изменения миокарда при применении стандартной диеты О развитии почечной недостаточности в группе контроля свидетельствовало повышение уровня креатинина к концу 2 мес. до 0,7±0,03 мкмоль/л и мочевины крови до 16,2±0,36 ммоль/л, что было достоверно выше, чем у ложнооперированных (ЛО) животных (р=0,050 и р=0,010, соответственно). На сроке наблюдения 4 мес. в группе НЭ было отмечено дальнейшее нарастание показателей креатинина и мочевины до 0,83±0,01 мкмоль/л и 18,4±4,7 ммоль/л соответ-ственно.Наэтом фонетакже определяласьпрогрессирующая гиперфосфатемия до 2,55±0,24 ммоль/л к 4 месяцу ХПН и транзиторная гипокальциемия на сроке 2 месяца с достижением показателя 0,92±0,09 ммоль/л, с последующей нормализацией концентрации на уровне 2,44±0,11 ммоль/л на сроке 4 месяца. Нарушение функции почек сопровождалось достоверным увеличением АД до 158,7±11,2 мм рт ст по сравнению с 124,3±7,07 мм рт ст у ЛО животных (р=0,002). Увеличение показателя АД сопровождалось нарастанием массы сердца и гипертрофией стенки левого желудочка по сравнению с ЛО животными - 1089,7±50,3 мг (р=0,004) и 2026,8±264,5 (р=0,000) соответственно. Отмечалось значительное увеличение толщины КМЦ (14,9±3,11 мкм) по сравнению с ЛО животными (12,3±2,9 мкм; р=0,000), а также увеличение показателя площади ядер КМЦ до 34,1±8,1 мкм2, что было значимо больше в сравнении с группой ЛО животных (28,0±10,1 мкм2; р=0,017) (табл. 3). При подсчете количества ядер в каждом отдельном КМЦ встречались КМЦ с количеством ядер от трёх до шести. В группе контроля были выражены склеротические изменения - площадь, занятая соединительной тканью (ПСТ), составила 4008,1 ±2185,7 мкм2, что было значимо больше, чем у ЛО животных (2517,8±919,8 мкм2; р=0,020) (рис. 1 ). Отмечалось значимое увеличение индекса Керногана (0,49±0,1 мкм) по сравнению с ложнооперированными животными (0,25±0,05 мкм; р=0,000), что было обусловлено нарастающей гипертрофией Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 63 Рис. 1. Миокард крысы из группы контроля: А - сосуд артериального типа: гипертрофия мышечной стенки, округлый просвет сосуда, тесное расположение эндотелиоцитов); Б - периваскулярный и диффузный склероз. Окраска: А - гематоксилин и эозин; б - окраска по Ван Гизону. Ув. х200 Таблица 1. распределение животных в группах исследования. Рацион Контрольная группа Экспериментальная группа (МБД) ЛО n = 5 n = 4 НЭ 5/6 n = 7 n = 7 Примечание: ЛО - «ложнооперированные» крысы; НЭ - нефрэктомия; МБД - малобелковая диета Таблица 2. Параметры морфометрического исследования Объект исследования Параметр, ед. измерения Кардиомиоциты Толщина стенки левого желудочка (ТЛЖ), мкм Толщина кардиомиоцита (Ткмц), мкм Площадь ядра кардимиоцита (ПЯкмц), мкм2 Количество ядер в кардиомиоците, шт Количество многоядерных кардиомиоцитов, % Соединительная ткань Площадь соединительной ткани (ПСТ), мкм2 Сосуды артериального типа Толщина стенки сосуда (ТСС), мкм Диаметр просвета сосуда (ДПС), мкм Индекс Керногана (ИК), (толщина стенки сосуда/диаметр просвета сосуда) Капилляры микроциркуляторного русла Площадь просвета капилляра (Пкап), мкм2 Количество капилляров, шт Таблица 3. Показатели морфометрических методов исследования Название группы Толщина КМЦ, мкм Площадь ядра, мкм2 ПСТ, мкм2 ТСС, мкм ДПС, мкм ИК Пкап, мкм2 Группа контроля НЭ 5/6 14,1±3,1 34,1±8,1 4008,12 ±2185,78 26,4±17,6 61,7±27,9 0,49±0,1 2139,1 ±396,5 ЛО 12,3±2,9 28,0±10,1 2517,88 ±919,83 17,6±5,1 79,9±14,3 0,25±0,05 2197 ±230,4 Экспериментальная группа НЭ 5/6 9,5±1,9 26,6±4,7 2837,60 ±1263,19 29,9±7 89,6±14 0,38±0,1 1061,1 ±78,3 ЛО 10,8±2,3 24,3±4,4 2879,05 ±2203,41 17,1±4,7 62,9±18,8 0,28±0,16 2512,6 ±196,9 Примечание: ПСТ - площадь соединительной ткани; Пкап - площадь просвета капилляров; ИК - индекс Керногана; ДПС - диаметр просвета сосута; ТСС - толщина стенки сосуда; КМЦ - кардиомиоцит; НЭ - нефрэктомия; ЛО - ложнооперированные Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 4. биохимические показатели животных на сроке 4 мес. Параметр НЭ 5/6, M±ст.откл ЛО, M±ст.откл Межгрупповые различия, р. МБД n=7 Без МБД n=7 МБД n=4 Без МБД n=5 МБД Без МБД Креатинин, мкмоль/л 0,07±0,01 0,083±0,01 р=0,552 0,03±0,002 0,03±0,0005 р=0,058 0,0001 0,0001 Мочевина, ммоль/л 10,2±2,06 18,4±4,7 р=0,001 3,57±1,14 6±0,67 р=0,010 0,0001 0,0001 Кальций, ммоль/л 2,33±0,1 2,44±0,11 р=0,104 2,31±0,1 2,41±0,07 р=0,170 0,763 0,701 Фосфор, ммоль/л 2,12±0,10 2,55±0,24 р=0,001 2,07±0,094 2,07±0,08 р=0,908 0,401 0,006 Примечание: ЛО - «ложнооперированные» крысы; НЭ - нефрэктомия; МБД - малобелковая диета стенок артерий (НЭ 4 месяца - 26,4±17,6 мкм против 17,6±5,1 мкм; р=0,000). Патогистологические изменения миокарда в экспериментальной группе Применение МбД обеспечило снижение показателей креатинина и мочевины на сроке 4 месяца до 0,07±0,01 мкмоль/л и 10,2±2,06 ммоль/л соответственно. Также у животных экспериментальной группы определялось снижение уровня фосфора в крови до 2,12±0,1 ммоль/л и нормализация уровня кальция (2,33±0,1 ммоль/л) (табл. 4). Масса сердца у животных экспериментальной группы составила 843,4±165 мг и достоверно не отличалась от показателя ЛО животных (901,2±38,9 мг; р=0,487). Уровень системного АД на фоне применения МбД составил 120,3±12,8 мм рт ст и был достоверно ниже в сравнении с группой контроля, получавших стандартный рацион (158,7±11,2 мм рт ст; р=0,0001). При этом толщина стенки ЛЖ у крыс экспериментальной группы составила 1911,7±267,7 мкм, тогда как у крыс группы контроля - 2323,8±382,2 мкм (р=0,0001). На этом фоне также отсутствовали выраженные дистрофические изменения в кМц, такие как миоцитолиз и контрактуры. Таким образом, применение МбД обеспечило стабилизацию биохимических показателей на сроке 4 месяца, что сопровождалось сохранением нормального показателя АД и препятствовало развитию гипертрофии миокарда левого желудочка. Применение МбД в модели ХПН обеспечило снижение степени среднего показателя толщины КМЦ (9,5±1,9 мкм) в сравнении с животными группы контроля (14,1 ±3,1 мкм; р=0,0001), что сопровождалось уменьшением показателя площади ядер КМЦ (26,6±4,7 мкм2). Количество многоядерных КМЦ было меньше (0,3%), чем у животных группы контроля (1%). Структурные изменения стромального компонента при применении МбД характеризовались менее выраженным склерозом - средний показатель ПСТ у крыс экспериментальной группы составил 2837,6±1263,1 мкм2, в сравнении с группой контроля - 4008,1±2185,7 мкм2; р=0,061. В группе животных с НЭ, получавших МбД, площадь капилляров была меньше (1061,1±78,3 мкм2) в сравнении с животными, получавшими стандартный корм, (2139,1±396,5 мкм2; р=0,0001). В экспериментальной группе ДПС сосудов составляет в среднем 89,6±14 мкм, тогда как у животных с НЭ, получавших стандартный корм, 61,7±27,9 (р=0,003). На этом фоне средний показатель ИК был значительно ниже, чем в группе контроля - 0,38±0,1 против 0,49±0,1 (p=0,012). Обсуждение Комплексное морфологическое исследование миокарда крыс в модели ХПН выявило достоверные изменения во всех структурных компонентах - кардиомиоцитах, строме и сосудах. Увеличение массы миокарда и гипертрофии стенки левого желудочка на гистологическом уровне проявлялось нарастанием дистрофических изменений, достоверным увеличением толщины кардиомиоцитов, появлением трехъядерных и многоядерных КМЦ. Это сопровождалось увеличением объёма соединительной ткани, а также снижением количества капилляров и увеличением толщины стенки сосудов артериального типа. Аналогичные результаты были продемонстрированы другими авторами, которые использовали модель резекции 5/6 массы почечной ткани у крыс как экспериментальную модель ХПН [8]. Компенсаторная гипертрофия КМЦ сопровождалась увеличением объёма их ядер. Увеличение объёма ядра гипертрофированного КМЦ свидетельствует об усилении активности генов, отвечающих за синтез сократительных и регуляторных белков, что также подтверждается результатами наблюдений других исследователей [9]. При этом было замечено, что прирост объема цитоплазмы не сопровождался резким увеличением объема ядра, о чем свидетельствовало прогрессирующее снижение показателя ядерно-цитоплазматического отношения. О преобладании повреждения при ХПН над компенсаторными возможностями миокарда свидетельствует наличие склероза - на 4 месяце площадь занятой соединительной тканью увеличилась вдвое (19% от общей площади препарата). Полученные данные сопоставимы с результатами аналогичных исследований [10]. Одной из основных причин склероза в миокарде при ХПН принято считать прогрессирующую гипоксию (гемическую, циркуляторную и тканевую), при которой метаболизм переходит на анаэробный путь гликолиза. При этом возрастает потребность в большей концентрации глюкозы в крови. Происходит накопление молочной кислоты. АТФ расщепляется до АДФ и затем до аденозина, который проходит через мембрану КМЦ и попадает в кровеносное русло [11]. Вследствие этого формируется энергетическая недостаточность миокарда, что является предпосылками к гибели КМЦ при хронической гипоксии, и замещение их соединительной Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 тканью. Параллельно в условиях хронической гипоксии в результате активации фибробластов активно синтезируется коллаген I и III типов, обусловливающий развитие в миокарде метаболического склероза, как диффузного, так и периваскулярого [12]. Было показано, что в миокарде человека с СН на кардиомиоцитах и стромальных клетках миокарда увеличивается количество рецепторов к инсулин-подобному фактору роста, что делает эти клетки более чувствительными и к другим факторам роста [13]. Изменения метаболизма при хронической почечной недостаточности сопровождаются увеличением концентрации маркеров воспаления, включающих фибриноген, С-реактивный белок, IL-6 и TNF-a [14]. Это обеспечивает усиление экспрессии молекул адгезии на поверхности эндотелиоцитов и фиксацию циркулирующих иммунных клеток, которые стимулируют миграцию и хоуминг моноцитов в периваскулярном пространстве. При этом некоторые цитокины оказывают прямое повреждающее действие на кардиомиоциты. Например, фактор некроза опухолей (Tumor Necrosis Factor - TNF) оказывает негативный инотропный эффект на миокард, а его перманентное воздействие на кардиомиоциты сопровождается дозозависимым увеличением объёма ЛЖ и снижением фракции выброса [15]. результаты клинических исследований демонстрируют, что повышение уровней CRP, IL-6 и фибриногена является независимым предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений при ХПН. Таким образом, одним из компонентов поражения миокарда при почечной недостаточности является хроническое латентное воспаление. Известно, что одним из механизмов репаративной регенерации миокарда после повреждения у некоторых видов животных является пролиферация кардиомиоцитов [16]. У млекопитающих такая особенность продемонстрирована на мышах линии Murphy Roth Large (MRL) - в ядрах кардиомиоцитов была выявлена S-фаза митотического цикла [18]. В настоящем исследовании в модели ХПН было отмечено появление трехъядерных и многоядерных кардиомиоцитов (до шести ядер в одном кардиомиоците). В единичных кардиомиоцитах регистрировались ядра позитивно окрашенные в иммуногистохимической реакции с антителами к Ki-67, что может свидетельствовать о наличии процессов внутриклеточного деления (эндомитоз). Таким образом, выявленные морфологические признаки усиления регенеративных процессов в кардиомиоцитах с преобладанием эндомитоза можно представить, как один из компенсаторно-приспособительных механизмов при прогрессировании ХПН.

About the authors

N. V Shved

Moscow City Oncology Hospital № 62

Email: nika2485@yandex.ru
Moscow, Russia

V. V Baykov

I.P. Pavlov the First Saint-Petersburg State Medical University

Email: nika2485@yandex.ru
Saint-Petersburg, Russia

References

Supplementary files