Stady of the role of human pyrophosphatase NUDT13 in regulation of the nad level in mitochondria

Abstract

Full Text

Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) является основным коферментом в окислительно-восстановительных реакциях центральных метаболических путей. Также NAD является субстратом для нескольких семейств регуляторных белков, контролирующих важнейшие механизмы жизнедеятельности клетки. На данный момент неизвестно, каким образом регулируется митохондриальный пул NAD, который необходим для осуществления таких ключевых метаболических процессов, как цикл трикарбоновых кислот, окисление жирных кислот и синтез ATP. В рамках данного исследования мы проверяем возможность регуляции митохондриального NAD за счет его расщепления пирофосфатазой NUDT13. К настоящему моменту функции NUDT13 в клетках человека не установлены. Прежде всего, нами была подтверждена митохондриальная локализация рекомбинантного FLAG-слитого белка NUDT13 после сверхэкспрессии в клетках человека. Далее для оценки изменения уровня митохондриального NAD мы использовали клеточную модель, которая представляет собой сверхэкспрессию каталитического домена поли-АДФ-рибозилполимеразы PARP1 в митохондриальном матриксе (Mito-PARP). В присутствии NAD Mito-PARP авто-поли-АДФ-рибозилируется, при этом, чем выше концентрация NAD в митохондрии, тем больше образуется полимеров АДФ-рибозы (PAR). Уровень PAR оценивается методом иммуноблоттинга. Ко-экспрессия Mito-PARP с белком NUDT13 приводит к значительному снижению уровня PAR в митохондриальном матриксе. Это позволяет предположить, что пирофосфатаза NUDT13 может расщеплять NAD и таким образом регулировать уровень данного динуклеотида в митохондрии. Чтобы подтвердить способность NUDT13 расщеплять NAD до мононуклеотидов NMN и AMP in vitro, мы оптимизировали метод аффинной очистки данного белка, слитого с 6xHis, после сверхэкспрессии в E. coli. В дальнейшей работе мы охарактеризуем субстратную специфичность пирофосфатазы NUDT13.