A GENETICALLY ENCODED FLUORESCENT TEMPERATURE SENSOR DERIVED FROM THE PHOTOACTIVE ORANGE CAROTENOID PROTEIN

Abstract

Full Text

Неоднородность метаболических реакций приводит к неравномерному распределению температуры в разных частях живой клетки. Для изучения нормального функционирования и патологических нарушений клеточных процессов необходима разработка новых методов визуализации, которые позволят легко интерпретировать данные, и не будут требовать введения синтетических красителей в клетку. Оранжевый каротиноидный белок (ОСР) с массой 35 кДа представляет собой небольшой водорастворимый фотозащитный белок цианобактерий, состоящий из двух структурных доменов с заключенной между ними молекулой кето-каротиноида. Константы скорости фотопреобразования и релаксации OCP сильно зависят от температуры, а его третичная структура претерпевает значительные структурные перестройки при фотоактивации, что делает оранжевый каротиноидный белок функциональной частью генетически кодированного наноразмерного сенсора температуры. Мы конъюгировали зеленый и красный флуоресцентные белки (TagGFP и TagRFP) со структурой OCP, создав фотоактив-ные химеры. В таких химерах электронное возбуждение флуоресцентного белка эффективно гасится каротинои-дом в OCP, что позволяет измерять скорости конверсии путем мониторинга изменений интенсивности флуоресценции. Такой подход позволил нам определить локальную температуру микросреды. Из-за высокой энергии активации релаксации OCP (~ 32 ккал / моль), показания флуоресценции такого сенсора на основе OCP могут потенциально обеспечить точность измерения температуры до 0,1 °С. Нами было показано, что фотоактивные химерные конструкции на основе OCP и флуоресцентных белков чувствительны к температуре in vitro. После оптимизации химер и введения белковых частей для селективной доставки в определенные компартменты клетки, химеры на основе OCP можно использовать для измерения внутриклеточной температуры, специфичной для органелл и компартментов.