Dependence of cloning efficiency on the degree of differentiation of the nucleus donor cell

Full Text

За последние 10 лет экспериментов по переносу ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит с целью клонирования организмов или создания линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) было установлено, что успех процедуры зависит от степени дифференцировки клетки донора ядра. Так, было постулировано, что при использовании ядра ЭСК вероятность рождения жизнеспособных клонов повышается в 5-10 раз [1]. Это привело к рождению гипотезы использования ядра «взрослой» стволовой клетки для улучшения результативности процедуры клонирования [2]. Логично предположить, что «полностью репрограммировать» ядро стволовой или прогениторной клетки теоретически легче, чем терминально дифференцированной. Справедливость такого подхода совсем недавно была показана в эксперименте, использующем в качестве донора ядра нейральную стволовую клетку [2]. Кроме того, попытки клонирования мыши из постмитотического обонятельного нейрона [3] и зрелых Т-, B-лимфоцитов [4] оказывались удачными только при применении двух-шагового протокола путём химеризации бластоцисты или тетраплоидного эмбриона клонированными ЭСК [3, 4].

Международная группа исследователей из нескольких университетов США и Японии недавно завершила интересное исследование, показывающее зависимость эффективности клонирования мыши от степени дифференцировки клетки-донора ядра. Исследователи предположили, что вероятность развития и рождения клонов будет выше при переносе ядра зрелой постмитотической клетки по сравнению со взрослой стволовой. Гипотеза базировалась на результатах недавней работы японской группы Кimiko Inoue из университета RIКEN, продемонстрировавшей, что эффективность репрограммирования ядра и клонирования мыши из гемопоэтической стволовой клетки неожиданно оказалась очень низкой [5]. В настоящем эксперименте авторы также использовали гемопоэтические клетки одной линии дифференцировки, поскольку ГСК у мыши, на сегодняшний день, являются самыми хорошо описанными примерами «взрослых» стволовых клеток. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Genetics.

Для сравнения эффективности клонирования были использованы ядра высокоочищенных клеток крови одной линии дифференцировки гемопоэтической стволовой (ГСК), гемопоэтической прогениторной клетки (ГП) и постмитотического гранулоцита (Г) мыши. Эффективность клонирования ранних эмбрионов (на стадии морулы-бластоцисты) оказалась значительно ниже при использовании ГСК (%) по сравнению с ГП (11%) и Г (35%). Большинство эмбрионов, полученных от ГСК, останавливались в развитии на 2-4-клеточной стадии. Авторам удалось получить 2 мышат при переносе ядра постмитотического гранулоцита. Частота клонирования при этом составила 1,1%. В контрольных экспериментах использование ядер кумулюсных и эмбриональных стволовых клеток приводило к развитию бластоцисты с частотой 53,3% и 49% соответственно, а также к рождению клонированного потомства в 3% и 9% случаев соответственно, что совпадает с данными, полученными другими группами исследователей [1, 6].

Авторы указывают, что это первое документированное исследование, показывающее возможность клонирования мыши непосредственно путём переноса ядра постмитотической терминально дифференцированной клетки. Все клетки доноры ядер в эксперименте были тщательно охарактеризованы фенотипически (получены методом клеточного сортинга) и функционально (реконституция костного мозга после пересадки ГСК и ГП, исследование колониеобразования). Было показано, что гранулоциты, используемые в работе, не были способны совершать клеточные деления. В отличие от этой работы, все клетки, используемые другими группами исследователей (кумулюсные [6], NКT [7], фибробласты) были способны митотически делиться. Попытка использования постмитотичекой клетки приводила к успеху только при использовании двухступенчатого протокола (химеризации зародыша клонированными ЭСК) [3, 4].

Безусловным достоинством работы является использование системы одного «гемопоэтического дифферона» (ГСК-ПГ-Г) для сравнения эффективности клонирования в зависимости от степени дифференцировки клетки донора. Пока авторы не могут объяснить, почему ГСК (взрослая стволовая клетка) обладает меньшим потенциалом к репрограммированию и клонированию, чем зрелые клетки. Аналогичные неожиданные результаты при использовании ГСК были получены до этого и японской группой [5]. Сравнительные исследования глобальной генной экспрессии позволят идентифицировать гены или эпигенетические признаки, ответственные за большую частоту репрограммирования клеточного ядра. Поскольку использование ЭСК по-прежнему приводит к самой высокой частоте клонирования, авторы предполагают, что общие гены «стволовости» ЭСК и ГСК, по-видимому, не отвечают за репрограммирование ядра клетки при его переносе в овоцит. Robert Blelloch в недавней работе указывает, что частота репрограммирования в цитоплазме овоцита зависит от степени метилирования донорского ядра [2].

Таким образом, полученные данные опровергают популярную гипотезу о возможном улучшении эффективности репрограммирования ядра и клонирования организмов при использовании менее дифференцированной клетки-донора (взрослой стволовой или прогениторной). Интересно было бы проверить эти данные на клетках человека. Кроме того, поскольку в эксперименте с использованием нейральных стволовых клеток были получены противоположные результаты [2], в будущем предстоит сравнить несколько типов взрослых стволовых клеток в рамках одного исследования.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files