The role of directed migration of SDF-1-CXCR4 while homing cells-precursors in malignant dessemination

Abstract

The review deals with recent data on molecular mechanisms of migration and colonization of tissues and organs by stem cells, cellsprecursors. /n this direction the scientific literature emphasizes recently-described molecules stromal derived factor-1 {SOF-1) and its receptor {CXCR4).

Full Text

Роль миграционной оси SDF-1-CXCR4 в хоуминге клеток-предшественников и метастазировании злокачественных опухолей *

Введение

Адекватный ответ нормальных стволовых клеток, как эмбриональных, так и дефинитивных тканей, на морфогенетические факторы и хемоаттрактанты играет ключевую роль в развитии органов в онтогенезе, а также в процессах обновления тканей и их регенерации в случае повреждений. Помимо этого, хемоаттрактанты регулируют метастазирование опухолевых стволовых клеток, которые, как было недавно показано, образуются в результате блокирования дифференцировки стволовых клеток, а не дедифференцировки дефинитивных соматических клеток, как предполагалось ранее [1]. В последнее время появляется всё больше экспериментальных свидетельств того, что как нормальные, так и опухолевые стволовые клетки экспрессируют на своей мембране ассоциированный с гетеротримерными G-белками трансмембранный рецептор CXCR4, связывающийся со специфическим лигандом молекулой SDF-1 (stromal derived factor), которая вырабатывается стромальными клетками многих тканей. Экспрессия как SDF-1, так и его рецептора повышается при гипоксии и механических травмах, что приводит к усиленной миграции клеток-предшественников в зоны повреждения. По этой причине растёт интерес исследователей к разработкам новых фармакологических подходов, направленных на модуляцию миграционной оси SDF-1-CXCR4. В будущем это может позволить стимулировать хоуминг нормальных CXCR4+ стволовых клеток в повреждённые органы, а также предотвратить метастазирование CXCR4+ опухолевых клеток.

Stromal derived factor (SDF-1/CXCL12)

В настоящее время наиболее хорошо изученным фактором хоуминга стволовых и прогениторных клеток костного мозга является белок SDF-1/CXCL12, относящийся к хемокинам (обширная группа консервативных, мультифункциональных низкомолекулярных медиаторов, которые могут опосредовать иммунный ответ, выживание стволовых клеток, а также запускать хемотаксис и ангиогенез [2-5]) семейства CXC. Этот фактор существует в организме в виде двух различных белков со сходными функциями, образующихся в результате альтернативного сплайсинга: SDF-1a и SDF-1b, и в трёх формах: мембранной, связанной с экстрацеллюлярным матриксом и растворимой.

Впервые кДНК SDF-1a была клонирована в 1988 году группой S.I. Nishikawa et al. [6], а в 1996 году C.C. Bleul et al. обнаружили, что SDF-1 является хемоаттрактантом для лейкоцитов, под его влиянием происходит перестройка их цитоскелета [7].

К настоящему времени клонировано 50 различных хемокинов и 20 хемокиновых рецепторов [8, 9]. Обычно один и тот же хемокин может связываться с несколькими разными рецепторами, но SDF-1 исключение из этого правила. Он способен взаимодействовать только с CXCR4 (по CD-номенклатуре: CD184), что косвенно подчёркивает его уникальную биологическую роль [10]. Совсем недавно был описан новый рецептор SDF-1, названный RDC1, однако его возможная роль в регуляции миграции клеток ещё не подтверждена [1].

SDF-1 имеет ряд различных функций, в которые входят ингибирование апоптоза, стимуляция пролиферации, усиление адгезии, подвижности клеток, хемотаксиса и миграции. Он работает как во взрослом организме, так и на ранних этапах онтогенеза, участвуя в перемещении гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из аорто-гонадо-мезонефрального компартмента зародыша в желточный мешок, а затем в эмбриональную печень и далее в костный мозг и селезёнку. При этом ГСК мигрируют по градиенту SDF-1a, что усиливается в присутствии Steel factor (SLF) [11]. Таким образом, SDF-1 можно назвать одним из самых важных морфогенетических факторов и хемоаттрактантов для всех типов CXCR4+ клеток в онтогенезе организма (рис. 1).

Рис. 1. Роль оси SOF-1-CXCR-4 в миграции и циркуляции стволовых клеток, и при метастазировании опухолевых клеток. По [49] с изменениями

SDF-1 секретируется, главным образом, стромальными фибробластами костного мозга [12], но также обнаруживается в клетках различных тканей, таких как поперечнополосатая и сердечная мышечные, нервные клетки, спленоциты и гепатоциты [13].

Количество мРНК SDF-1 резко возрастает в повреждённой сердечной мышечной ткани, почках и печени (в экспериментах были проверены воздействия на органы гипоксии и g-излучения), в результате чего CXCR4+ клетки периферической крови рекрутируются в область повреждения [14]. А.T. Askari et al. (2003) показали, что после инфаркта миокарда уровень экспрессии SDF-1 клетками сердечной мышцы стремительно возрастает и снижается только к седьмым сутками. Проверив влияние трансплантации клеток, трансфецированных геном SDF-1, на хоуминг CD34+ c-kit+ стволовых клеток костного мозга в зону повреждения, исследователи выяснили, что этого достаточно для мобилизации стволовых клеток (СК), однако их последующей дифференцировки в кардиомиоциты практически не происходило. Предполагается, что главную роль в дальнейшей дифференцировке клеток играют факторы семейства TGFb. Тем не менее, сосредоточение клеток в зоне повреждения приводит к развитию новых сосудов и улучшению сердечной деятельности [15].

Хемотаксис по градиенту концентрации SDF-1 демонстрируют около 18% мононуклеарных клеток костного мозга и примерно 22% мононуклеаров селезёнки, которая также является «резервуаром» CXCR4+ клеток-предшественников [14].

Рецептар SDF-1 трансмембранный белак CXCR4

В 1996 году С.С. Bleul et al. [3] и Е. Oberlin et al. [16] независимо друг от друга обнаружили, что рецептором для SDF-1 является белок LЕSTR/fusin, или CXCR4 (по номенклатуре хемокиновых рецепторов), участвующий в слиянии Т-тропного вируса иммунодефицита человека с CD4+ лимфоцитами хозяина. Несколькими годами позже, в 1999 году, A. Peled et al. [17] показали, что SDF-1 и его рецептор задействованы в репопуляции костного мозга SCID мышей, в то время как антитела к CXCR4 блокируют хоуминг трансплантированных клеток.

Молекула CXCR4 имеет семь трансмембранных доменов, каждый из которых играет свою роль в запуске каскада сигналов, и ассоциирована с Gai-белком, что позволяет ей передавать сигнал в ядро клетки [18].

CXCR4 маркер многих стволовых/прогениторных клеток [12]. Экспрессия функционального CXCR4 обнаружена на миосателлитах поперечнополосатой мускулатуры [19, 20], примордиальных клетках гонад зародыша [21, 22], нейральных стволовых клетках [23], а также на предшественниках пигментных клеток сетчатки и на гепатоцитах [24, 25]. Известно, что ось SDF-1-CXCR4 регулирует миграцию и хоуминг пре-В-лимфоцитов (кроме того, CXCR4 является фактором роста пре-В-клеток) и Т-лимфоцитов, а также эмбриональных стволовых клеток мыши [26]. CXCR4 экспрессируется на глиальных клетках и нейронах, а SDF-1 выступает важным фактором роста астроцитов, стимулируя их пролиферацию [27].

Совсем недавно была обнаружена экспрессия CXCR4 на мультипотентных мезенхимных стромальных клетках (ММСК) костного мозга. На мембранах клеток он присутствовал в очень незначительном количестве (им обладало от 1% до 3% клеток), тем не менее, он играл определенную роль в их миграции: при блокировании CXCR4 моноклональными антителами, процент мигрировавших клеток снизился примерно на 50%. Интересно, что при этом от 83% до 98% ММСК содержали рецептор в цитоплазме, причём в двух формах: в «обычной» (весом 66 КДа) и в N-гликозилированной (весом 130 КДа). Функционально активна N-гликозилированная форма, и при инактивации/расщеплении N-терминального пептида рецептор, оказавшийся на мембране, теряет свою активность [28].

Несмотря на то, что клетки повреждённых тканей секретируют в большом количестве SDF-1, привлекая прогениторные клетки, среда в зоне повреждения, богатая протеолитическими ферментами, такими, как сериновые протеазы, катепсин G, эластазы и матриксные металлопротеиназы, может нарушать нормальный хоуминг клеток, расщепляя N-терминальный пептид CXCR4. Предполагается, что нахождение способа стимуляции выхода внутриклеточного CXCR4 на мембрану клетки может стать ответом на вопрос, каким образом усилить хоуминг и миграцию МСК в костном мозге [28].

CXCR4 экспрессируют клетки ряда опухолей, таких как рабдомиосаркома, нейробластома, глиобластома, нефробластома, гепатобластома и ретинобластома. Хорошо развитая система кровоснабжения костного мозга и экспрессия клетками стромы SDF-1 и ряда других хемоаттрактантов делает костный мозг «мишенью» для метастазов опухолей, экспрессирующих на своей поверхности CXCR4 [29-34]. Все эти опухоли развиваются из малодифференцированных мышечных, нейральных, клеток почечного эпителия, пигментных клеток сетчатки и гепатоцитов это позволяет предположить, что их метастазы мигрируют именно по градиенту SDF-1.

Гиперэкспрессия гена CXCR4 была обнаружена в более чем 75% опухолей различного происхождения, неполный список которых включает рак молочной железы, яичников, лёгких, кишечника, простаты, пищевода, почек, поджелудочной железы, меланому, некоторые формы лейкоза.

Клетки ряда опухолей секретируют молекулы, повышающие экспрессию CXCR4 и SDF-1. Например, клетки глиобластомы, экспрессируя в больших количествах VЕGF (vascular endothelial growth factor), стимулируют не только ангиогенез, но и экспрессию CXCR4, что позволяет опухоли активно метастазировать. Медиана выживаемости пациентов с такой CXCR4+high опухолью составляет менее одного года [35].

Экспериментальные животные, нокаутные по генам SDF-1 и CXCR4, погибают in utero, демонстрируя сильно сниженное количество гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Эти животные имеют множественные пороки развития сердечно-сосудистой системы и головного мозга [36, 37]. Такие последствия дефектов генов SDF-1 и CXCR4 предполагают ключевую роль миграционной оси SDF-1-CXCR4 в органогенезе и миграционных процессах самых различных клеток в норме и при патологии.

Регуляция миграцианнай оси SDF-1-CXCR4

Для лучшего понимания запуска SDF-1-CXCR4 сигналинга нужно отметить, что хемотаксис и хоуминг (по крайней мере, ГСК) зависит от содержания в мембранах клеток холестерина и включения в подвижные участки мембраны, обогащённые гликосфинголипидами, сфингомиелином и холестерином (рафты) CXCR4 и малой ГТФазы Rac-1 [38]. Такая близкая локализация рецептора и ГТФазы облегчает активацию Rac-1 и запуск дальнейшей последовательности событий [39]. По этой причине CXCR4 может быть сенситизирован факторами лейкафереза/мобилизации, которые, повышая его ассоциацию с рафтами, позволяют ему более тонко реагировать на градиент SDF-1. Возможно, именно этим объясняется то, что ГСК при мобилизации из костного мозга демонстрируют более высокую степень энграфтмента, чем ГСК пуповинной крови [38]. Препараты, нарушающие формирование липидных рафтов мембраны (например, полиеновые антибиотики) могут препятствовать метастазированию CXCR4+ опухолей, также как и агенты, нарушающие внутриклеточный синтез холестерина (напр., статины) (рис. 2).

Рис. 2. Модуляция оси SDF-1-CXCR4 внешними факторами. По [49] с изменениями

В некоторых клетках CXCR4-сигналинг зависит от концентрации SDF-1a. Так, в низких концентрациях (около 100 нг/мл) SDF-1 усиливает миграцию Т-лимфоцитов, в высоких же не только снижает, но и служит для клеток репеллентом [40]. Такая же закономерность выявляется и для CD34+ гемопоэтических клеток, способность которых к хоумингу в костный мозг NOD/SCID реципиентов в присутствии высоких концентраций SDF-1 (50 мкг/106 клеток) заметно снижается [41, 42]. Предварительная инкубация клеток с SDF-1 или антителами к CXCR4 (в исследованиях использовался клон 12G5) перед их трансплантацией реципиенту усиливает последующий ответ клеток на SDF-1 примерно вдвое, не влияя на пролиферацию и апоптоз. Это происходит благодаря тому, что предварительная инкубация с SDF-1 повышает уровень фосфорилирования сигнальных молекул, стимулирует реорганизацию актинового цитоскелета и увеличивает адгезию клеток через молекулы VLA-4 и VCAM [43-45]. Обработка гемопоэтических клеток SDF-1 в течение двух-трёх дней приводит к усилению активности металлопротеиназ, а также повышает выживаемость. При этом SDF-1 никак не влияет на прохождение клетками клеточного цикла [46]. Возможно, такая зависимость от концентрации лиганда проявляется в результате работы различных сигнальных механизмов, зависящих от разных концентраций SDF-1.

Функции SDF-1/CXCR4 осуществляются посредством вторичных мессенджеров, активируемых вслед за Gai-белком. Считается, что SDF-1, связавшись с CXCR4, вызывает его димеризацию, как это происходит, например, в случае рецепторов факторов роста [47]. После этого активированный комплекс CXCR4-SDF-1 быстро интернализуется (уходит в цитоплазму в составе мембранного пузырька) [48]. Интернализованный CXCR4 может затем вновь выйти на поверхность клетки и выполнять там свои функции. Установлено, что интернализацию комплекса SDF-1-CXCR4 можно ингибировать гепарином, ограничивающим количество доступного

SDF-1, и липополисахаридом бактерий, который напрямую ингибирует контакт SDF-1 с рецептором [49]. Также интернализация ингибируется при связи L-селектина на поверхности клетки с фукоиданом и сульфатидом, являющимися селектин-связывающими лигандами [50]. Эндоцитоз CXCR4 может быть необходим не только для регуляции сигналинга, но и для хемотаксиса и запуска MЕK-MAPK р42/44 киназного каскада [33, 34].

При взаимодействии SDF-1 с его рецептором в клетке на короткое время возрастает опосредованная работой малой ГТФазы Rho концентрация Ca2+, необходимая для перестройки цитоскелета (увеличения количества F-актина в цитоплазме), формирования фокальных контактов и миграции.

Повышение концентрации Ca2+ в клетке активирует пролин-богатую киназу-2 (Pyk-2), киназу фокальной адгезии (FAK), и ряд других значимых молекул, запуская сигнальные пути через MAPK р42/44-ЕLK-1 и PI-3K-AKT-NF-кB [52-55]. После связывания CXCR4 немедленно обнаруживается резкое повышение степени фосфорилирования компонентов фокальной адгезии, MAPK р42/44 и серин-треониновой киназы AKT [56, 57].

CXCR4 сигналинг включает также активацию Ras (один из наиболее распространённых протоонкогенов) и нескольких киназ семейства Src, в том числе ZAP-70 молекулу, активирующую Т-клетки. Некоторые могут активироваться, возможно, посредством трансфосфорилирования, независимо от Gai белка, после чего в процесс передачи сигнала могут вовлекаться транскрипционные факторы семейства STAT, которые далее тоже фосфорилируются киназами [58]. STAT-белки, привлекаемые в процессе сигналинга, строго тканеспецифичны [47].

Существуют весомые аргументы в пользу того, что в модуляцию CXCR4-индуцированного сигналинга включены также протеин-тирозиновые фосфатазы SHIP1 и SHIP2, а также гемопоэтическая мембран-ассоциированная фосфатаза CD45 (рис. 3).

Рис. 3. Пути передачи сигнала, активируемые осью SDF-1-CXCR4. По [49] с изменениями

Нельзя забывать о том, что большинство механизмов проведения сигнала в клетке многократно дублируется, и путь запуска хоуминга и миграции клеток через связывание SDF-1 с CXCR4 не исключение. Показано, что при ингибировании CXCR4 хоуминг ГСК не нарушается благодаря компенсации выключения SDF-1-CXCR4 пути взаимодействием a4-интегрина с VCAM-1 (при проведении схожих экспериментов с лейкозными клетками было выяснено, что их хоуминг при блокаде CXCR4 нарушается). При блокировании же обоих этих механизмов хоуминг клеток значительно снижался или практически отсутствовал. По-видимому, других значимых

«обходных путей» SDF-1/CXCR4 клетка не имеет [59].

На взаимодействие SDF-1 с его рецептором влияет множество факторов, в том числе и цитокиновое микроокружение клетки. Установлено, что воздействие SCF (Stem Cell Factor) повышает экспрессию CXCR4 клетками стромы костного мозга и усиливает миграцию по крайней мере c-kit+ клеток.

Такие факторы, как анафилотоксин C3a (фрагмент токсина, расщепляющий С3 компонент комплемента), des-ArgС3а (продукт расщепления С3а карбоксипептидазой), фибронектин, фибриноген, тромбин, VCAM-1, гиалуроновая кислота и сфингозин-1-фосфат усиливают хемотаксис CXCR4+ клеток по градиенту SDF-1 [49, 60, 61]. Из этого, опять же, следует, что ось SDF-1-CXCR4 в значительной степени регулируется соединениями, высвобождающимися при повреждении тканей (des-ArgС3а, С3а анафилотоксин, фибронектин, гиалуроновая кислота), коагуляции крови (фибриноген, тромбин) и активации клеток (s-VCAM-1, s-ICAM-1). Воспаление тесно связано с прогрессией опухолей, что можно объяснить влиянием воспалительных молекул (С3а, фибриногена, фибронектина, гиалуроновой кислоты) на усиление метастазирования CXCR4+ опухолей.

Подводя итог, заметим, что в настоящее время о сигнальных путях в клетке можно с известной долей уверенности сказать, что «всё связано со всем»: функции белков разнообразны, и часто один и тот же белок в зависимости от своего местонахождения в клетке может играть совершенно противоположные роли. Однако тонкая регуляция клеточных процессов обеспечивает дифференциальный запуск различных сигнальных путей, и в разных клеточных линиях задействуются разные молекулы.

Терапевтические подходы к воздействию на миграционную ось SDF-1-CXCR4

В связи с развитием методов клеточной терапии и необходимостью управления миграцией трансплантированных клеток, развиваются и представления исследователей о роли факторов хоуминга как в здоровом организме, так и при патологии, в особенности при развитии опухолей. Помимо этого, CXCR4 является корецептором для Т-тропного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), взаимодействуя с белком вирусного капсида gр120 и облегчая проникновение вириона в клетку хозяина, что также не может не привлекать повышенного внимания к этой молекуле.

Сегодня CXCR4 потенциальная мишень борьбы с опухолями. Доказано, что рецептор играет важную роль на всех стадиях прогрессии опухоли: пролиферации клеток первичной опухоли, их метастазировании. Недавно компания Northwest Biotheraрeutics (NWBT) на трёх моделях различных злокачественных опухолей провела клинические испытания нового моноклонального антитела к CXCR4. Эти исследования были призваны проверить, как повлияет блокада рецептора на течение заболевания. Результаты подтвердили сильное влияние антител к CXCR4 на все стадии развития опухоли:

• Медиана выживаемости удвоилась; 95% животных, участвовавших в эксперименте, прожили более чем 110 дней, при этом средняя выживаемость в контрольной группе не превышала 45 дней.
• Количество метастазов в лёгких уменьшилось на 75%.
• Размер первичной опухоли молочной железы снизился на 60%.

«Редко бывает так, что один белок играет важную роль на всех трёх функциональных стадиях развития раковых клеток, не говоря уже о его участии в течении нескольких различных видов рака», утверждает профессор Алтон Бойнтон (Alton Boynton) из Northwest Biotheraрeutics, «CXCR4 предлагает исключительную терапевтическую возможность как для предотвращения роста первичной опухоли, так и её метастазирования. И, что самое важное, эффект антител к CXCR4 коррелирует с заметным увеличением продолжительности жизни. Зачастую препараты, замедляющие опухолевый рост, не увеличивают медиану выживаемости больных раком. Результаты доклинических испытаний моноклональных антител к CXCR4 позволяют нам начать первую фазу клинических испытаний» [62].

Гиперэкспрессия CXCR4 обнаруживается более чем в 75% опухолей различного типа. Более того, экспрессия CXCR4 коррелирует с низким уровнем выживаемости.

Компанией AnorMЕD Inc. был также разработан препарат AMD3100 антагонист CXCR4. Этот агент предполагается использовать для мобилизации ГКС. При использовании AMD3100 совместно с Г-КСФ наблюдается синергетический эффект. В настоящее время препарат завершает вторую фазу клинических испытаний [63].

Таким образом, миграционная ось SDF-1-CXCR4 задействуется при множестве типов опухолей и агенты, влияющие как на лиганд, так и на рецептор, могут сыграть в будущем значительную роль в терапии злокачественных заболеваний.

* По материалам Kucia M., Reca R., Miekus K., Wanzeck J. Trafficking of Normal Stem Cells and Metastasis of Cancer Stem Cells Involve Similar Mechanisms: Pivotal Role of the SDF-1 CXCR4 Axis. Stem Cells 2005; 23: 879-94.