Guided growth and migration of bone marrow stromal cells in culture in vitro

Full Text

Введение

В последнее время все большее внимание исследователей привлекают возможности клеточной трансплантации для коррекции патологии скелетных тканей. Показано, что клетки с облигатной или факультативной остеогенной детерминацией (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), стромальные клетки костного мозга, остеогенные клетки, остеобласты) при их трансплантации в организм реципиента участвуют в процессах остеогенеза. Такие сведения получены при свободных пересадках указанных клеток в область переломов и дефектов костей [1, 2]. При системном введении ядросодержащих клеток костного мозга, включающих фракцию стромальных клеток, они также демонстрируют тропность к костной ткани реципиента и продуктивно участвуют как в репаративном (восстановительном) [3], так и в физиологическом [4, 5] костеобразовании. На использовании данного феномена основаны клинически приемлемые способы коррекции системных заболеваний костной ткани [6, 7].

Несмотря на большое количество полученных экспериментальных и клинических данных, механизмы данного явления остаются недостаточно изученными.

Цель работы: в модельной системе in vitro зарегистрировать признаки миграции или направленного роста стромальных клеток костного мозга в ответ на остеогенный стимул.

Материал и методы

Культуру стромальных клеток кролика получали из костного мозга, заключенного в гребнях подвздошных костей. Клетки высеивали в одноразовую пластиковую посуду (чашки Петри) из расчета 5-7´10⁵ клеток на 1 см² площади дна. Среда имела следующий состав: DMEM (ISN, США) и F12 (ISN, США) в соотношении по объему 3:1 с добавлением 20% эмбриональной коровьей сыворотки (Биолот, РФ; ISN, США), гентамицина сульфата (50 мкг/мл). Смену среды производили каждые 3 суток. По достижении монослоя, культуру пассировали в одноразовой посуде, на дне которой были уложены круглые покровные стекла диаметром 1,0 см. После того, как поверхность стекол полностью покрывалась клетками, их извлекали и монтировали в новых чашках Петри точно в центре. Культуральная среда имела прежний состав. В зависимости от опыта культивирование проводили в присутствии аутогенных по отношению к клеткам жизнеспособных и девитализированных костных фрагментов. Девитализацию проводили путем трехкратного быстрого замораживания-оттаивания. Контроль девитализации осуществляли при помощи помещения кусочков в питательную среду и с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Ни в одном случае не было обнаружено роста in vitro и целых жизнеспособных клеток. Также СЭМ подвергали жизнеспособные кусочки костей после культивирования.

В дальнейшем опыты повторили после нанесения на дно чашек коллагенового геля, получаемого из соединительной ткани сухожилий лабораторных животных. В качестве контроля использовали изолированную культуру стромальных клеток на покровных стеклах.

Через 1 неделю культивирования культуру фиксировали 4% раствором параформальдегида, окрашивали по Романовскому-Гимза (азур II-эозином). Состояние культуры оценивали визуально.

Подготовку препаратов костных фрагментов для сканирующей электронной микроскопии выполняли по традиционной методике [8]. Фиксировали 2% глютаровым альдегидом. После обезвоживания образцы покрывали медью в аппарате низкотемпературного напыления JFC-1100. Изучение проводили в сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-35C при ускоряющим напряжении 15 kV.

Результаты

В контроле клетки, находившиеся на покровных стеклах в центре чашек Петри, за срок наблюдения равномерно пролиферировали и мигрировали на дно чашки по всему периметру (рис. 1). Причем, на чашках, у которых дно было обработано раствором коллагена, этот процесс был более выражен. Иногда наблюдались свободные отсевы в виде дискретных единичных колоний.

 

Рис. 1. Результаты эксперимента: А сторона расположения девитализированного аутогенного костного фрагмента; В сторона расположения жизнеспособного костного фрагмента. Окраска: по Романовскому-Гимза

 

При культивировании стромальных клеток с фрагментами девитализированной кости достоверных данных в пользу влияния на рост колонии клеток не получено. Характер роста культуры был аналогичен контролю. Культура росла центробежно от покровного стекла, лишь незначительно распространяясь по дну культурального сосуда (см. рис. 1А). Этот процесс был несколько более выражен в чашках, покрытых коллагеновым гелем.

При кокультивировании с фрагментами аутогенных жизнеспособных кусочков костной ткани получены иные данные. На чашках, не обработанных коллагеном, наблюдали миграцию клеток с покровных стекол на дно, преимущественно в сторону локализации кусочка кости (см. рис. 1В). Причем, в ряде случаев клетки формировали колонии, вытянутые в сторону живой кости. В чашках, покрытых коллагеном, культура характеризовалась более выраженным ростом, большей площадью экспансии дна, причем, несмотря на то, что из-за многочисленных дискретных колоний, являющихся отсевами основной колонии и отсевами от сохранивших жизнеспособность клеток эксплантированного кусочка кости, преимущественное направление роста было сохранено в сторону живой кости.

При культивировании в одной чашке и девитализированного, и живого фрагмента кости клетки мигрировали преимущественно в сторону жизнеспособного кусочка (см. рис. 1В, А).

Обсуждение

Полученные в простом модельном эксперименте данные дают наглядное представление о том, каким образом процессы миграции могут осуществляться in vivo. В организме подобные ситуации могут возникать в случаях физиологической регенерации костной ткани, когда клетки камбиального резерва естественным образом расходуются на ремоделирование кости и поддержание ее морфофункционального гомеостаза. При репаративной регенерации для процессов остеогенеза рекрутируются костномозговые остеогенные клетки-предшественники, входящие составной частью в строму костного мозга. Показано, что помимо местной миграции под воздействием паракринных факторов хемоаттракции, указанные клетки способны мигрировать посредством системного кровотока [9]. Искусственно такая ситуация воспроизводится при трансфузиях. Молекулярные механизмы хоуминга данных клеток требуют особого обсуждения.

В сохранивших свою жизнеспособность клетках фрагментов костной ткани остеобластах, клетках периваскулярного микроокружения, заключенных в гаверсовых каналах идут активные цитофизиологические процессы. Ранее нами было показано, что эти клетки способны пролиферировать на поверхности эксплантированного костного фрагмента, мигрировать на подложку (рис. 2); синтезировать щелочную фосфатазу, свидетельствующую в данном случае об остеогенной дифференцировке клеток [10]. Следует предположить, что помимо синтеза щелочной фосфатазы, клетки в данных условиях вырабатывают и ряд других биологически активных молекул.

 

Рис. 2. Миграция стромальных клеток с фрагмента кости на дно культурального сосуда (А). Сканирующая электронная микроскопия. Ув.:x600

 

Большое внимание исследователей в последнее время приковано к Stromal-derived factor-1 (SDF-1). Оказалось, служащий аттрактантом для клеток различных типов, он способен воздействовать и на стромальные клетки в качестве аутоили паракринного регулятора. Возможно данный фактор является стадиеспецифичным, при нарастании остеогенной дифференцировки клеток их способность продуцировать SDF-1 снижается [11], вместе с тем показано, что дифференцированные остеобласты также продуцируют SDF-1 [12]. В экспериментах in vitro с остеобластами человека, стромальными клетками костного мозга человека, мыши и крысы установлено, что ряд цитокинов индуцируют выработку SDF-1, к ним относятся IL-1b, РDGF-ВВ, VEGF, TNF-a и паратиреоидный гормон; TGF-b1 уменьшает его выработку [13], что подтверждено идентификацией растворенного SDF-1 в культуральной среде.

Взаимодействие SDF-1 с его рецептором CXCR4 приводит к перестройкам цитоскелета клеток, благодаря которым становится возможной их миграция под действием хемотаксиса в локусы ремоделирования кости [13, 14]. Именно этому взаимодействию сегодня придают ведущее значение в хемоаттракции стромальных клеток.

Одним из ключевых факторов регуляции механоцитов являются костные морфогенетические белки (bone morphogenetic protein, ВMР). Они вызывают дифференцировку ММСК в клетки остеогенной линии. Сохраненный при особых условиях костный матрикс содержит факторы роста, в частности, ВMР, который является хемоаттрактантом для остеогенных клеток-предшественников, что показано в условиях in vitro путем микрокиносъемки в ответ на внесение в культуральную систему рекомбинантного ВMР-7 [15]. Аналогичный эффект вызывают ВMР-2, ВMР-4 в концентрации 10 нг/мл [16, 17], при этом отмечено, что rhTGF-b1 и rhbFGFне обладают таким свойством. Эти данные остаются весьма противоречивыми, так, Makhijani N.S. с соавт. (2005) показали дозозависмый положительный хемотаксис остеогенных клеток в ответ на внесение в культуральную среду трех изоформ трансформирующего фактора роста: на TGF-b1 или -b3 в чистом виде, а в ответ на TGF-b2 только в присутствии ретиноевой кислоты [1].

Фактор роста фибробластов был использован для биологически активной модификации скаффолда, позволяющей привлекать ММСК и оптимизировать их адгезию [19]; аналогичное применение находит и костный сиалопротеин [20].

Еще одним фактором, стимулирующим миграцию стромальных клеток является тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor, PDGF) [21-23]. Данный механизм, по мнению исследователей, может быть реализован при рекрутировании костномозговых предшественников остеобластов для ремоделирования костной ткани. Аналогичный эффект показан для сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), чья экспрессия весьма выражена при протекании энхондрального остеогистогенеза. С наличием этого фактора связывают привлечение и дифференцировку предшественников остеобластов из стромы костного мозга [24].

В ходе наших экспериментов установлено, что культура стромальных клеток костного мозга кролика обладает свойством реагировать особенностями роста и миграции на присутствие в культуральной системе жизнеспособной, но поврежденной костной ткани. В случае кокультивирования с девитализированной костной тканью, в которой помимо устранения жизнеспособных клеток-продуцентов биологически активных веществ, низкотемпературная обработка могла повлиять и на функциональную активность белков внеклеточного матрикса, культура стромальных клеток не демонстрировала изменение характера своего роста.

В присутствии жизнеспособной костной ткани клетки культуры активно мигрировали в сторону ее расположения. В случае, если дно чашки было покрыто коллагеном, клетки преимущественно не мигрировали на его поверхность, а активно пролиферировали, и колония, распространяясь центростремительно, занимала все большую площадь дна культурального сосуда. Коллаген, являясь основным белком внеклеточного матрикса соединительных тканей, представляет собой естественный субстрат для адгезии и пролиферации стромальных клеток, что используется для обработки поверхностей гидрофобных носителей для клеток (скаффолдов) [25, 26].

About the authors

R. V. Deev

Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Moscow

N. V. Tsupkina

Institute of Cytology RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, St. Petersburg

G. P. Pinaev

Institute of Cytology RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files