Investigation of expression and analysis of function of Sip1 gene in cerebral cortex development

Full Text

Введение

В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно-биологической и молекулярно-генетической техники. Понятно, что при этом особое внимание уделяется тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения, в первую очередь конечный мозг (теленцефалон).

Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональных структур, таких как таламус, гипоталамус, «обонятельный эпителий» и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.

Теленцефалон человека - это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных. Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон, откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением его морфологии. В этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно-биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Некоторый прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона, был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.

Ранее, с помощью метода вычитающей гибридизации нам удалось клонировать ряд транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга [1, 2].

В данной работе с помощью методов гибридизации in situ и иммуноокрашивания проведен детальный анализ паттерна экспрессии одного из генов (Sip1). Было установлено, что ген Sip1 начинает экспрессироваться рано и имеет дифференциальный характер распределения мРНК внутри коры головного мозга.

Белок Sip1 был обнаружен в двугибридной системе как белок, реагирующий с факторами транскрипции Smad [3]. Smad-белки являются внутриклеточными медиаторами путей передачи сигнала, запускаемого BМP и TGF-b. Последние регулируют процессы пролиферации, миграции, дифференцировки и запрограммированной клеточной гибели в развитии [4]. Ранее было показано, что инактивация гена BMP4 приводит к дефектам спецификации клеток медиального региона коры головного мозга [5].

SIP1 является транскрипционным репрессором [6, 7]. Также известно, что Sip1 у пациентов, страдающих недавно описанным синдромом Моуат-Вильсона - мутировал. Пациенты обнаруживают такие дефекты как умственная отсталость, микроцефалия, гипертелоризм, задержки в развитии моторных навыков и эпилептические припадки [8]. Из вышеизложенного следует, что Sip1 играет важную роль в развитии коры головного мозга.

Транскрипты гена SIP1 выявляются во многих тканях очень рано в эмбриональном развитии. Гомозиготы, несущие мутацию по гену SIP1, обнаруживают ряд дефектов производных нервного гребня уже на Е8.5 и погибают на десятый день эмбрионального развития (персональное сообщение D. Huylebroeck).

Вследствие ранней гибели эмбрионов проведение функционального анализа гена SIP1 в развитии конечного мозга является невозможным. Для установления роли SIP1 в регуляции развития коры головного мозга была выбрана стратегия тканеспецифической инактивации белкового продукта гена.

Было показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.

Материал и методы

Лабораторные животные

Основная работа проводилась на лабораторной линии мышей NМRA. Функциональный анализ гена Sip1 проводился на мышах со смешанным генетическим фоном C57BL6/J и CD1. Линия, несущая флоксированный аллель экзона 7 гена Sip1, была представлена в генетическом фоне CD1. Данная линия несет пару loxP-сайтов, фланкирующих экзон 7 гена Sip1. Две тысячи пар нуклеотидов экзона 7 содержат приблизительно половину от общей последовательности, кодирующей белок Sip1, включая 4 N-концевых домена типа цинковые пальцы, гомео-домен и Smad- и CtBP-связывающие домены. Индуцируемая Cre-рекомбиназой делеция приводит к сдвигу рамки считывания в последующем экзоне 8 и полной инактивации активной формы белкового продукта гена. Трансгенные линии, несущие Cre-рекомбиназу (EmxCre, Six3Сre) поддерживались в генетическом фоне C57BL6/J (F7). Операции по выделению эмбриональной ткани определенной области мозга производили микрохирургическими пинцетами под бинокулярным микроскопом.

Гибридизация in situ

Подготовку ткани, гибридизацию in situ, а также эмульсионную авторадиографию проводили по методике, описанной в [9].

Иммуногистохимический анализ

Парафиновые срезы гидратировали, как описано в [9], и постфиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS 5 мин. Преблокировали в растворе 1% BSA Ig free (Sigma)/0,1% Tween-20 на PBS 1 час. После преблокировки инкубировали 12 часов с первичными антителами (1:500), разведенными в растворе 1% BSA Ig free (Sigma)/0,1% Tween-20 на PBS. Несвязавшиеся первичные антитела отмывали тремя сменами PBS. Далее инкубировали со вторичными антителами (1:500), коньюгированными с HRP (DAKO). Окраска DAB/перекись водорода осуществлялась по стандартному протоколу.

Анализ морфологии посредством окрашивания срезов ткани мозга мыши по протоколу Nissl

Анализ морфологии проводился на парафиновых срезах. Препараты инкубировали 20 мин. в толуоле для удаления парафина, гидратировали последовательной сменой растворов 100%; 96%; 90; 80; 70%; 50%; 30% этанола по 2 мин., промывали водой два раза по 5 мин., далее инкубировали в течение 20 мин. в 30% растворе сульфида калия. После промывания водой срезы окрашивали в течение 20 мин. раствором cresyl violet, дважды промывали раствором, содержащим 1мМ ацетата натрия, 5мМ уксусной кислоты, инкубировали полминуты в растворе 10мМ уксусной кислоты и после промывания водой осуществляли дегидратацию ткани последовательной сменой растворов (30%; 50%; 70%; 80; 90; 96%; 100%) этанола.

Анализ уровня запрограммированной клеточной гибели

Фиксированные ткани, подготовленные, как описано в [9], постепенно переводили в среду для замораживания (Sakura). После отмывки в буфере PBS выделенные ткани переносились в 15% раствор сахарозы, приготовленный на PBS, и инкубировались 12 часов при качании при 4°C. Далее раствор 15% сахарозы меняли на 30% раствор и инкубировали при тех же условиях. Образцы помещали в специальные пластиковые кюветы и замораживали при температуре -80°С.

Срезы толщиной 5-7 мкм помещали на предметные стекла SuperFrost и высушивали на воздухе при 37°C в течение 1 часа. Детекция апоптоза проводилась в соответствии со стандартным протоколом Apoptag plus fluorescein in situ apoptosis detection kit (Serologicals Corporation). Использовались замороженные срезы стадии Е17 толщиной 10 мкм, приготовленные по описанной выше методике.

Результаты и обсуждение

Анализ паттерна экспрессии Sip1 в теленцефалоне

Анализ распределения мРНК гена Sip1 в коре головного мозга мыши показал, что Sip1 начинает экспрессироваться с 12-го дня эмбрионального развития. Транскрипты обнаруживаются, главным образом, в зоне кортикальной пластинки. Позднее, на стадии Е15, помимо кортикальной пластинки продукты гена Sip1 были найдены также в зоне клеточной пролиферации (вентрикулярной зоне) коры головного мозга (ГМ) (рис. 1А, Б). На 18-й день эмбриогенеза транскрипты гена Sip1 определяются только в кортикальной пластинке (рис. 1В-1И). В результате анализа распределения мРНК Sip1 на стадии Е18.5 был установлен интересный факт - региональная специфичность экспрессии гена Sip1 внутри кортикальной пластинки. В передней части коры большинство клеток Sip1-позитивны, а в каудальных ее зонах Sip1 экспрессируется только в клетках слоя VI (см. рис. 1В, Г, К, Л). Дифференциальный характер экспрессии в коре головного мозга воспроизводится также при иммуноокрашивании антителами против белка Sip1 (рис. 1О).

 

Рис. 1. Распределение мРНК гена Sip1 и белка Sip1 в головном мозге мыши в период эмбрионального и постнатального развития. Гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с сагиттальными и фронтальными срезами мозга мыши стадий Е15 (А, Б, Д, Ж) и Е1В (В, Г, 3, И, Т, У). К, Л - увеличенные виды В и Г, слои коры обозначены латинскими цифрами, региональная специфичность показана стрелками. М, Н, Р, С - распределение мРНК гена Sip1 в ткани мозга мыши, несущей мутацию Reeler. О - распределение белка Sip1 в коре на стадии Е1В; П - гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с фронтальными срезами ткани взрослого мозга мыши; 1 - неокортекс; 2 - гиппокамп; З - базальный ганглий; 4 - таламус; 5 - средний мозг; 6 - пириформная кора; 7 - обонятельная луковица

 

В области вентрального теленцефалона экспрессия гена Sip1 также показывает дифференциальный характер. Начиная с 12-го дня эмбрионального развития экспрессия гена Sip1 обнаруживается, главным образом, в пролиферативной зоне (вентрикулярная и субвентрикулярная зоны базального ганглия), в отличие от дорзальной части теленцефалона, где транскрипты Sip1 были найдены только в зоне дифференцировки (кортикальная пластинка). Также было установлено, что во взрослой ткани мозга основными регионами Sip1 экспрессии являются гиппокамп, зубчатая извилина и белое вещество коры головного мозга (рис. 1П).

Экспрессия Sip1 в Reeler-мутанте

Reeler - это мутация, которая характеризуется инвертированной стратификацией коры головного мозга. Ранее было показано, что данный дефект связан с мутацией гена реелин. Продукт гена реелин, белок внеклеточного матрикса, необходимый для нормального формирования коры в радиальном направлении. С мутациями гена реелин ассоциированы такие заболевания человека, как аутосомная рецессивная лизенцефалия и гипоплазия мозжечка. Мы исследовали экспрессию гена Sip1 в ткани мозга у новорожденных Reeler-мутантов мыши. В результате анализа

было установлено, что у дикого типа экспрессия гена Sip1 выявляется исключительно в верхних слоях пириформной коры, тогда как у мутанта экспрессия гена Sip1 в этой области имеет диффузный характер (см. рис. 1М, Н, Р, С).

Тканеспецифическая инактивация гена Sip1

Линия, несущая аллель Sip1^flox, была предоставлена коллегами D. Huylebroeck и T. Van de Putte из Фландерского института биотехнологии.

Нами было показано, что основными доменами экспрессии гена Sip1 в конечном мозге являются кортикальная пластинка и зона клеточной пролиферации (вентрикулярная зона) базального ганглия. Для установления функции гена Sip1 in vivo была создана линия мышей, несущих делецию экзона 7 в клетках коры головного мозга. Для этого была взята линия, несущая knock-in гена Cre в локус гена Емх1. Cre-pекомбиназа Емх1-Cre линии экспрессируется во всех клетках коры головного мозга, включая клетки-предшественники. Линия была создана K. Jones из университета Колорадо.

Первой стадией получения мутантов является совмещение трансгенов Sip1^flox и Cre в одном генотипе. Далее животных с генотипом Sip1^flox/⁺; Cre/⁺ (двойные трансгенные гетерозиготы) скрещивали между собой для получения мутанта Sip1^flox/Sip1^flox; Cre/⁺.

Фенотипический анализ мутантов, полученных при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга

Анализ морфологии ткани мозга на ранних стадиях кортикогенеза (Е12-Е18) не выявил существенных фенотипических различий между мутантом и диким типом. Проведенные исследования морфологии коры Sip1-мутантов (рис. 2) и анализ экспрессии генов показали, что зоны гиппокампа СА1-СА3 и зубчатая извилина нормально специфицируются в ходе эмбриогенеза.

 

Рис. 2. Анализ морфологии мозга мыши, несущей мутацию гена Sip1 в коре головного мозга с помощью окрашивания по протоколу Nissl. Корональные срезы ткани мозга мыши 17-го дня эмбрионального развития: А, В- дикий тип; Б, Г- мутант; к- кора головного мозга; с - subiculum; з - зубчатая извилина. Район зубчатой извилины отмечен стрелками

 

В норме СА1- СА3 зоны гиппокампа на 17-й день эмбрионального развития уже заложены, зубчатая извилина на данной стадии представлена четко выраженной структурой (см. рис. 2).

При морфологическом анализе поздних стадий нейрогенеза было обнаружено, что у взрослых животных полностью отсутствуют гиппокамп и зубчатая извилина (рис. 3). Медиальный район коры головного мозга представлен пре- и парасубикулярным комплексом. Зона subiculum выглядит значительно тоньше (см. рис. 3Б). Также интересным фактом является отсутствие corpus callosum у мышей, мутантных по гену Sip1 (см. рис. 3В, Г).

 

Рис. 3. Анализ морфологии ткани мозга мыши, полученной при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга. Окрашивание по протоколу Nissl корональных срезов ткани мозга мыши стадии РЗО: А, В - дикий тип; Б, Г - мутант; 1 - кора головного мозга; 2 - гиппокамп; З - зубчатая извилина; 4 - мозолистое тело

 

Как было показано раньше, зоны, отсутствующие у взрослых животных, нормально специфицируются в эмбриогенезе (см. рис. 2). Поэтому дальнейшим предположением было то, что дефект образуется вследствие низкого уровня пролиферативной активности клеток предшественников каудо-медиального района коры. Анализ клеточной пролиферации изучался с использованием метода иммуноокрашивания парафиновых срезов эмбриональной ткани мозга мыши антителами против бромдеоксиуридина. Разницы в уровне пролиферации между мутантом и диким типом на стадии Е16.5, т. е. в период, когда клетки каудо-медиального района кортекса отличаются максимальной пролиферативной активностью, выявлено не было.

Далее мы решили проверить уровень клеточной гибели в медиальном паллиуме. Окрашивание ткани мозга мыши стадии Е17.5 по протоколу TUNEL показало высокий уровень апоптоза у мутантов в медиальном районе коры. В остальной части коры уровень апоптоза остается одинаковым при сравнении мутанта и дикого типа (рис. 4).

 

Рис. 4. Анализ уровня клеточной гибели в ткани мозга эмбриона мыши, полученной при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга. Окрашивание по протоколу TUNEL фронтальных срезов ткани мозга мыши стадии Е17: А, В - дикий тип; Б, Г - мутант; В, Г - увеличенные виды, выделенные прямоугольниками на А и Б. Стрелками обозначены клетки, показывающие окраску

 

Недавно стало известно, что мутация гена Sip1 у человека приводит к изменениям в развитии медиального паллиума. Интересно также, что у пациентов с мутированным геном Sip1 наблюдается агенез мозолистого тела. В результате анализа морфологии мозга мышей, мутантных по Sip1, были обнаружены подобные дефекты (см. рис. 3В, Г).

Ранее в литературе был описан ряд направленных генных мутаций, приводящих к дефектам развития медиального паллиума. Было показано, что Wnt3А локально регулирует рост каудомедиальной части коры, из которой формируется гиппокамп [10]. При инактивации Wnt3a, медиатора Wnt сигнального пути Lef1 [11], так же как и фактора транскрипции Emx2 [12], спецификация клеток-предшественников каудомедиальной зоны кортекса проходит нормально, однако гиппокамп не формируется вследствие дефекта пролиферации.

Недавно было показано, что Emx2 является прямой транскрипционной мишенью Wnt и Bmp [13]. Для экспрессии Emx2 в дорзальной части теленцефалона также необходима активность медиаторов Wnt- и Bmp-сигнального пути, факторов транскрипции Smad и Tcf. Ранее было показано, что Smad- белки, медиаторы Bmp сигнального пути напрямую реагируют с Sip1. Также известно, что один из членов генного семейства Tcf – Tcf8/ZEB-1 выполняет функцию, обратную функции Sip1/ZEB-2 в регуляции TGF-b/BМP-сигнального пути. Мутации генов Wnt3a, Lef1, Етх2 и Sip1 приводят к схожим фенотипическим проявлениям.

Для более точного установления роли Sip1 в развитии медиальной коры и о месте Sip1 в генной иерархии Wnt- и Tgfp-сигнального пути требуются дальнейшие исследования. На основании выше приведенных данных можно сделать вывод о том, что активность гена Sip1 необходима для нормального развития таких компонентов медиальной коры, как гиппокамп и зубчатая извилина.

About the authors

A. S. Polyakov

Institute of Gene Biology, RAS

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of neurogenetics and genetics of development

Russian Federation, Moscow

L. I. Korochkin

Institute of Gene Biology, RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of neurogenetics and genetics of development

Russian Federation, Moscow

G. V. Pavlova

Institute of Gene Biology, RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of neurogenetics and genetics of development

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files