Effect of Bone Marrow Cell Intramyocardial Autotransplantation upon Perfusion of Ischemic Myocardium in Experiment

Толық мәтін

Введение

Ишемическая болезнь сердца [ИБО] представляет собой широко распространенное заболевание и является основной причиной смертности в большинстве промышленно развитых стран мира [1]. Необратимое повреждение кардиомиоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности. Используемые в настоящее время для лечения ишемии миокарда консервативные и оперативные методы не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин [2]. В связи с этим разрабатываются новые способы влияния на регенерацию пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии. Так, в последние 5-7 лет успешно реализуется идея клеточной трансплантации для лечения ИБО. При этом многообещающим стал метод трансплантации клеток с целью замещения некротизированного миокарда вновь образованными кардиомиоцитами и стимуляции неоангиогенеза [3, 4]. Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Одним из них является вопрос о наиболее эффективном типе клеток для стимуляции ангиогенеза. В эксперименте на модели острого инфаркта миокарда было предложено использовать различные типы клеток для стимуляции неоангиогенеза в ишемизированой зоне: гемопоэтические стволовые клетки [5], эндотелиальные прогениторные клетки пуповинной крови [6], эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные в периферический кровоток [7], эндотелиальные прогениторные клетки костного мозга [8], ядросодержащие клетки [ЯСК] костного мозга [9] и периферической крови [10], мультипотентные мезенхимные стромальные клетки [ММСК] костного мозга [11]. Из всего многообразия используемых типов клеток наиболее перспективным является трансплантация аутогенных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии, которая обычно требуется после трансплантации эмбриональных и фетальных клеток, а также в связи с отсутствием этических и юридических проблем. Данные литературы свидетельствуют, что в настоящее время среди аутогенного клеточного материала чаще всего используются ядросодержащая фракция костного мозга и ММСК костного мозга [12]. Однако экспериментальных работ по сравнительной эффективности трансплантации этих клеток мало, а полученные результаты противоречивы.

Большинство экспериментальных работ по изучению влияния трансплантации клеток на репарацию миокарда выполнялись на модели инфаркта миокарда у мелких грызунов, которые, как известно, обладают выраженными адаптационными способностями, что, с нашей точки зрения, не позволяет достоверно оценить эффект от проводимой терапии [13].

Для моделирования инфаркта в эксперименте используются разнообразные способы воздействия на миокард: низкие и высокие температуры, лазер, токсины, фармакологические препараты и т. п. [14]. К сожалению, эти способы не позволяют в полной мере воспроизвести ситуацию, возникающую в клинике. Достаточно точно данный патологический процесс удается имитировать путем перевязки коронарной артерии.

Для оценки эффективности влияния трансплантации клеток на кровоснабжение ишемизированного миокарда применяются различные методы. В настоящее время золотым стандартом в оценке уровня перфузии и метаболизма миокарда являются однофотонная эмиссионная компьютерная томография [ОФЭКТ] и позитронно-эмиссионная томография. Использование этих методов в эксперименте представляется весьма привлекательным, однако зачастую из-за величины изучаемого объекта получаемое разрешение не позволяет проводить оценку данных [1 5].

Кроме того, для определения эффективности и безопасности трансплантации клеток важно проводить оценку результатов не только в ближайшие, но и в отдаленные сроки. Однако большинство исследований отражает оценку результатов в среднем до полугода, а результаты на более поздних сроках представлены единичными сообщениями [12].

Цель работы - оценить влияние аутогенной трансплантации клеток костного мозга на перфузию миокарда у кроликов после инфаркта, моделированного путем коронароокклюзии, с использованием метода ОФЭКТ на разных сроках.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах-самцах линии Шиншилла массой 2,7-3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 месяца.

1. Выделение, культивирование и характеристика полученных клеток

В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, полученные из аспирата костного мозга.

Аспират костного мозга получали путем пункции крыла подвздошной кости после премедикации [дроперидол 0,5 мг/ кг, ксилазин 14 мг/кг] под местным обезболиванием 0,5% раствором новокаина. Аспират в количестве 10 мл помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS [citrate phosphate dextrose solution]. Полученный костный мозг фракционировали с помощью центрифугирования [1600g, 20 мин] в градиенте плотности Перколла [63%]. Образовавшееся интерфазное кольцо с ЯСК костного мозга промывали в растворе Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали в среде аМЕМ и использовали либо для дальнейшего культивирования, либо для трансплантации без культивирования.

Жизнеспособность ЯСК костного мозга определяли в камере Горяева с помощью окраски трипановым синим.

Клетки культивировали в среде аМЕМ [ISN, США] с 10% сыворотки эмбрионов коров [Hyclone, Новая Зеландия] и гентамицина сульфата [50 мкг/мл] в СО₂-инкубаторе при 5% концентрации углекислого газа. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту [50 мкг/ мл]. Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА [Gibco, США].

Рис.1. Лигирование передней нисходящей ветви левой коронарной артерии

Рис. 2. Введение клеток в ишемизированную зону миокарда левого желудочка

Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT [Sigma, США] на щелочную фосфатазу [ЩФ] для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и суданом-ІІІ [BDH Chemicals Ltd, Англия] для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

2. Моделирование инфаркта миокарда

Для моделирования инфаркта миокарда кроликам после премедикации (дроперидол 0,5 мг/ кг, метацин 0,8 мг/ кг] и эндотрахеальной интубации в условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом (кетамин 32 мг/ кг, ксилазин 14 мг/ кг, дитилин 3 мг/ кг] в четвертом межреберье слева выполнялась торакотомия. Затем осуществлялась перикардиотомия и перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца (рис. 1 ). Сразу после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально с помощью инсулинового шприца вводили клетки или эквивалентное количество питательной среды (рис. 2). Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. Интраоперационная летальность составила 10%, послеоперационная - менее 2%.

Все животные были разделены на 3 группы. Животным 1 -й группы (n=12) в пораженную зону инъекционным способом вводилась культура ММСК (2x106), животным 2-й группы (n=14] вводилась ядросодержащая фракция костного мозга (2x106), животным 3-й группы (контрольная, n=15) вводилась ростовая среда аМЕМ.

3. Окрашивание клеток

Окрашивание клеточных культур и ЯСК костного мозга проводили с помощью флуорохрома Hoechst (Sigma, США] в концентрации 1 мкг/мл. Идентификацию окрашенных клеток в сердце осуществляли после ферментативной обработки миокарда смесью трипсин-коллагеназы (Sigma, США]. Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop» (Zeiss, Германия].

4. Оценка перфузии миокарда

Оценку уровня перфузии миокарда проводили через 20-25 минут после внутривенного введения радиофармацевтического препарата (РФП]^99mТс-тетрофосмина (Myoview] в дозе 30-50 МБк методом ОФЭКТ (двухдетекторная гамма-камера E.Cam. var, Siemens]. В каждой группе исследование осуществляли до выполнения операции и в определенные сроки после моделирования инфаркта: 10 суток, 1,5 месяца, 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев. Для количественной оценки уровня перфузии использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в зоне моделированного инфаркта к таковому в интактной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значения пикселя в патологической и референтной зонах (рис. 3).

Рис. 3. Перфузионная томосцинтиграмма миокарда кролика: 1 – референтная зона; 2 – патологическая зона

Все эксперименты на животных выполнены в соответствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты и обсуждение

В результате культивирования клеток, выделенных из аспирата костного мозга, была получена культура клеток - ММСК, которые образовывали колонии фибробластоподобных клеток, а плотный монослой формировали к 7-10 суткам (рис. 4). После окрашивания ММСК смесью реактивов BCIP-NBT участков, положительно окрашенных на ЩФ, выявлено не было. Окрашивание культуры клеток суданом-III также дало отрицательный результат.

Для изучения влияния трансплантированных клеток на перфузию поврежденного миокарда, прежде всего, необходимо было определить местонахождение введенных клеток. Детекция флуоресцентно окрашенных клеток в миокарде кроликов показала присутствие меченых клеток в зоне ишемического повреждения (рис. 5]

После трансплантации ММСК и ЯСК в ишемизированный миокард уровень перфузии определяли с помощью метода ОФЭКТ. Сводные данные уровня перфузии миокарда представлены в табл.

При количественной оценке перфузионных томосцинтиграмм миокарда кроликов через 10 суток после операции во всех группах отмечалось снижение перфузии в области передней стенки левого желудочка. В 1-й группе значения накопления РФП составили 0,81±0,01, во 2-й группе - 0,75±0,03, в контрольной группе - 0,59±0,01.

Рис. 4. Культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, полученных из костного мозга кролика, 21-е сутки культивирования, окраска азуром II. Увеличение x20

Рис. 5. Флуоресцентная микроскопия препарата миокарда кролика после ферментативной диссоциации. Стрелками обозначены ядра трансплантированных клеток, меченых флуорохромом Hoechst. Увеличение x400

Таблица. Значения уровня накопления РФП после трансплантации клеток костного мозга на разных сроках эксперимента (M±m)

Примечание: р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Через 1,5 месяца после операции в 1-й и во 2-й группах наблюдалось существенное улучшение перфузии. Средние значения накопления РФП составили 0,92±0,03 и 0,89±0,03 соответственно. В контрольной группе - 0,62±0,02.

К 3-му месяцу после операции полная нормализация перфузии отмечалась в опытных группах, где уровень накопления РФП составил 1,00±0,02 и 0,98±0,01, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличился и равнялся 0,61 ±0,01.

Рис. 6. Перфузионные томосцинтиграммы миокарда кроликов: первая группа — трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга; вторая группа — трансплантация ядросодержащих клеток костного мозга; третья группа — контроль

На сроках 6 и 12 месяцев во всех группах уровень перфузии достоверно не отличался от показателей, выявленных при исследовании через 3 месяца после операции (рис. 6).

Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах на 10-е сутки после операции составили: в 1-ой группе - 2,7±0,2 и 2,1±0,2; во 2-ой - 2,6±0,2 и 1,8±0,3; в контрольной - 2,8±0,3 и 2,1 ±0,1.

Через 1,5 месяца после моделирования инфаркта в 1-й и во 2-й группах эти значения достоверно не отличались (2,1 ±0,1 ; 1,8±0,2 и 2,2±0,1 ; 1,9±0,2); в контрольной группе неравномерность перфузии нарастала и составила 2,9±0,2 в пораженном сегменте по отношению к 1,9±0,1 в интактном сегменте.

На сроках 3 месяца, 6 и 12 месяцев в опытных группах динамики показателей равномерности перфузии не отмечалось. В контрольной группе по мере возрастания срока наблюдения происходило выраженное увеличение неравномерности перфузии в патологической зоне по отношению к референтной. К 3-му месяцу после операции этот показатель составил в патологической зоне 3,5±0,2, в референтной 2,0±0,1, через 6 месяцев 5,4±0,2 и 2,2±0,3, через 12 месяцев - 5,3±0,3 и 2,1±0,1 (рис. 7).

Представленные результаты показывают, что трансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к улучшению перфузии ишемизированного миокарда. Клетки, полученные из аспирата костного мозга, при культивировании образовывали колонии фибробластоподобных клеток, которые, по мнению А.Я. Фриденштейна (1991), являются потомками стволовой стромальной клетки [16]. Результаты окрашивания клеточной культуры реактивом BCIP-NBT и суданом-III показали отсутствие спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки клеток, что подтверждает их низкую дифференцировку. D. Orlic et al. (2001 ) показали, что недифференцированные ММСК обладают тропностью к поврежденным тканям и при трансплантации в зону альтерации активно участвуют в репаративных процессах [17]. ММСК вырабатывают некоторые гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хемокины, а также экспрессируют рецепторы некоторых цитокинов и ростовых факторов. In vitro показано, что ММСК продуцируют цитокины: IL-1 a, IL-p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, рецепторы для IL-1a, IL-1P, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, TNFa (tumor necrosis factor) [18, 19]. Многие из этих цитокинов продуцируются конститутивно, а другие - только после стимуляции. 

Рис. 7. Равномерность распределения РФП после трансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (первая группа) и ядросодержащей фракции (вторая группа) костного мозга в патологической (обозначена красным цветом) и референтной (обозначена синим цветом) зонах

P. Azarnous et al. продемонстрировали способность ММСК после трансплантации в поврежденный миокард крыс вырабатывать цитокин HIF-1a (hypoxia-inducible factor-1 а), который оказывает цитопротективное действие и ингибирует апоптоз, что позволяет трансплантированным клеткам выжить в условиях ишемии [20]. Кроме того, ММСК могут продуцировать факторы SDF-1 (stromal cell derived factor-1), SCF (stem cell factor), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), способные дополнительно вызывать мобилизацию и хоуминг ММСК костного мозга в ишемизированный миокард и пролиферацию трансплантированных ММСК [21]. Этот механизм позволяет увеличить количество ММСК в миокарде. Участие ММСК в неоангиогенезе связано со способностью этих клеток секретировать ангиогенные факторы, такие как VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), TGF-p (transforming growth factor P), ангиопоэтин-1 и экспрессировать на своей поверхности рецепторы для VEGF (VEGFR2), фибронектина, ламинина, молекулы адгезии ICAM-1, ICAM- 2, VCAM-1 [22]. Среди многочисленных факторов ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF, являясь важным паракринным фактором нормального развития коронарной сосудистой сети. Так, A. Al-Khaldi (2003) на модели острого инфаркта миокарда после введения ММСК с помощью моноклональных антител блокировал рецепторы к VEGF и не получал эффекта стимуляции ангиогенеза [11]. Вырабатываемые ММСК ангиогенные факторы способны мобилизовать про- гениторные эндотелиальные клетки из костного мозга, стимулировать пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и вызывать дифференцировку трансплантированных в миокард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, перициты, фибробласты, которые затем становятся компонентами сосудистой стенки [23].

Таким образом, выявленное нами улучшение перфузии можно объяснить тем, что при попадании в поврежденный миокард ММСК способны активно участвовать в неоангиогенезе за счет продукции многочисленных ангиогенных факторов, мобилизации и хоуминга в инвалидизированный миокард ММСК и прогениторных эндотелиоцитов костного мозга, пролиферации и дифференцировки трансплантированных ММСК и регенерации эндотелия.

Трансплантация ЯСК костного мозга также приводила к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда. Эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию и содержат ММСК, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные эндотелиальные клетки, моноциты, лимфоциты и другие. ЯСК костного мозга после трансплантации в миокард секретируют ростовые факторы, создавая специфическое микроокружение, которое осуществляет контроль над процессами пролиферации и дифференцировки ММСК [9]. Однако роль этого механизма невелика, так как доля ММСК среди ЯСК минимальна. N. Takakura et al. (2000) показали, что гемопоэтические стволовые клетки способны продуцировать ангиогенные факторы роста, например, ангиопоэтин-1, который влияет на эндотелиальную дисфункцию путем повышения чувствительности эндотелия к ростовым факторам [24]. Присутствующие среди ЯСК костного мозга прогениторные эндотелиальные клетки также вырабатывают факторы роста и участвуют в формировании новых сосудов. Основной механизм влияния ЯСК костного мозга на процессы неоангиогенеза реализуется через секрецию ангиогенных факторов в больших количествах: VEGF, bFGF, TGF-p, PDGF (platelet-derived growth factor) и другие. Эти факторы стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и трансплантированных прогениторных эндотелиальных клеток. Синтезируемые ЯСК костного мозга цитокины также способны вызывать регенерацию эндотелия [12]. Таким образом, трансплантация ЯСК костного мозга в ишемизированный миокард приводит к усилению ангиогенеза, скорее всего, за счет выработки большого количества ангиогенных факторов, стимуляции регенерации эндотелия, участия прогениторных эндотелиальных клеток в образовании новых сосудов, регуляции процессов пролиферации и дифференцировки ММСК.

В контрольной группе не было отмечено увеличения перфузии ишемизированного миокарда, а дефект перфузии сохранялся на всех сроках исследования. После коронароокклюзии в ишемизированный миокард из крови попадают нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, которые вырабатывают разнообразные цитокины и ростовые факторы [VEGF, bFGF, TGF-p, IL-a, IL-1 p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15) [25]. Однако в силу того, что в миокарде отсутствуют ММСК, а количество секретируемых ангиогенных факторов невелико, вероятно, процессы неоангиогенеза в поврежденном миокарде не выражены. Вместо этого развивается фибропластическая реакция стромы, проявляющаяся в пролиферации фибробластов, расположенных между группами кардиомиоцитов и вокруг сосудов.

Заключение

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что интрамиокардиальная аутотрансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда в эксперименте. Можно предположить, что трансплантированные ММСК, главным образом, влияют на процесс неоангиогенеза за счет их дифференцировки в сосудистые структуры и выработки ангиогенных факторов, а ЯСК - за счет секреции ростовых факторов. Однако механизм неоангиогенеза после трансплантации клеток до конца не изучен, что требует проведения дальнейших исследований.

Авторлар туралы

A. Matyukov

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Ресей, Saint-Petersburg

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар

Әрекет

1. JATS XML

Жүктеу

2. Fig.1. Doping of the anterior descending branch of the left coronary artery

Жүктеу (83KB)

Метадеректер

3. Fig. 2. Introduction of cells into the ischemic zone of the left ventricular myocardium

Жүктеу (80KB)

Метадеректер

4. Fig. 3. Perfusion tomoscintigraphy of rabbit myocardium

Жүктеу (8KB)

Метадеректер

5. Fig. 4. Culture of multipotent mesenchymal stromal cells obtained from rabbit bone marrow, 21st day of cultivation, azur II staining. Magnification x20

Жүктеу (107KB)

Метадеректер

6. Fig. 5. Fluorescence microscopy of rabbit myocardium preparation after enzymatic dissociation. The arrows indicate the nuclei of transplanted cells labeled with Hoechst fluorochrome. Magnification x400

Жүктеу (10KB)

Метадеректер

7. Fig. 6. Perfusion tomoscintigrams of rabbit myocardium: the first group is transplantation of multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells; the second group is transplantation of nucleated bone marrow cells; the third group is control

Жүктеу (60KB)

Метадеректер

8. Fig. 7. Uniformity of RFP distribution after transplantation of multipotent mesenchymal stromal cells (the first group) and the nucleated fraction (the second group) of bone marrow in the pathological (indicated in red) and reference (indicated in blue) zones

Жүктеу (46KB)

Метадеректер

9. Fig. 7_2

Жүктеу (92KB)

Метадеректер