Treatment of sickle cell anemia with a combination of gene therapy and RNA interference
- Authors: Lopatina T.V.
- Issue: Vol 1, No 2 (2006)
- Pages: 11-12
- Section: Cell technology
- Submitted: 01.02.2023
- Accepted: 01.02.2023
- Published: 15.02.2006
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/181602
- DOI: https://doi.org/10.23868/gc181602
- ID: 181602
Cite item
Full Text
Full Text
Явление РНК-интерференции [RNA interference] было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК у С. elegans. Термин «РНК-интерференция» [iRNA] для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire в 1998 году [1, 2]. РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК] [рис.].
РНК-интерференция уже широко изучается с терапевтической целью, например, для подавления экспрессии вирусных генов, онкогенов или специфических генов, вызывающих заболевания [3]. Достоинства этого метода - высокая специфичность [подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой двухцепочечной РНК]; высокая эффективность [экспрессия гена подавляется более чем на 90%, несколько десятков молекул двунитевой РНК могут привести к деградации нескольких тысяч молекул РНК-мишени].
Пока терапевтическое использование РНК-интерференции ограничено, во-первых, жесткими условиями выбора гена, работу которого надо подавить, во-вторых, индукцией ответа иммунной системы на экзогенную РНК, которая может привести к полному подавлению синтеза белка и апоптозу [4, 5]. Регуляция синтеза siRNA в определенное время и в определенных клетках позволит минимизировать возможное повреждающее действие РНК-интерференции. Применение РНК-интерференции в клеточной терапии требует точного, высокоспецифичного определения гена, играющего главную роль в развитии заболевания, так как РНК-интерференция заставляет этот ген «замолчать».
Ученые из Sloan-Kettering Institute [New York, NY, USA] впервые показали возможность использования РНК-интерференции вместе с трансгенезом при лечении серповидноклеточной анемии [СКА].
Причина СКА заключается в однонуклеотидной замене урацила на аденин, в результате чего синтезируется цепь молекулы глобина с глютамином, вместо валина. Замена одной аминокислоты оказывается достаточной, чтобы изменить функциональные свойства гемоглобина [пониженная растворимость, повышенная полимеризация]. При этом гемоглобин уже не может выполнять кислородакцепторную функцию и кристаллизуется при недостатке кислорода, а эритроциты приобретают серповидную форму, склеиваются, тромбируют капилляры и т. д. Мутантный ген получил название βs, в отличие от нормального β-глобина.
На первом этапе эксперимента, авторы закодировали в интрон у-глобинового гена шпильку РНК [small hairpin RNA, shRNA], которая позволяет построить малые интерферирующие РНК [small interfering RNA, siRNA], комплементарные гену-мишени. Совместная экспрессия гена и siRNA позволяет специфически подавлять уровень транскриптов гена-мишени для siRNA строго в определенных клетках и на определенной стадии. Положение shRNA в интроне позволяет достигнуть синхронного уровня экспрессии экзогена и siRNA.
По расчёту учёных, трансфекция гемопоэтических стволовых клеток с мутацией β> βs, приводящей к развитию СКА, должна привести к транскрипции у-глобина с одновременной редукцией экспрессии βs-глобина - белка, ответственного за возникновение этой болезни.
Для исследования возможности использования этого метода в терапии ученые выбрали гены, экспрессирующиеся в клетках эритролейкемии крысы [murine erythroleukemia, MEL]: green fluorescent protein [GFP] и murine β-major [Mp], Клетки MEL были трансфецированы конструкцией с у-глобином и shRNA, а затем подвергнуты дифференцировке для запуска эндогенной экспрессии глобина.
В клетках, трансфецированных вектором, содержащим shRNA, комплементарную Мр, содержание транскриптов этого гена снизилось на 86% уже на шестой день после трансфекции. При трансфекции вектором с другой вставкой shRNA уровень транскрипции гена Мр не менялся, что доказывает высокую специфичность подавления экспрессии. В случае трансфекции клеток, экспрессирующих GFP белок, вектором с комплементарной вставкой, уровень флуоресценции тоже понижался на 85%. Это доказывает возможность избирательного, высокоспецифичного подавления экспрессии генов в определенное время. Также были показаны различия этого подавления в зависимости от положения вставки shRNA внутри интрона.
Известно, что введение экзогенной РНК вызывает иммунный ответ, а именно активацию системы интерферона [4, 5]. Авторы изучили иммунный ответ на трансфекцию созданной ими конструкции, а именно проанализировали уровень транскрипции генов, вовлеченных в систему интерферона. Выяснилось, что экспрессия этих генов увеличивается вместе с увеличением экспрессии вектора клонирования. Однако, при уменьшении размера транскрибируемой вставки, а также при некоторых положениях вставки shRNA, этот эффект уменьшается. Эти результаты можно учесть при применении РНК-интерференции in vivo.
Учёные трансфецировали человеческие гемопоэтические столовые клетки [С034+] от здоровых людей [генотип р/р] и от пациентов - гомо- [βs/βs] и гетерозигот [β/βs] с СКА. После дифференцировки этих клеток, индуцированной эритропоэтином, подтвердилось строго специфичное снижение уровня транскриптов βs, тогда как уровень β-глобина существенно не снизился. В то же время можно было детектировать транскрипцию гена у-глобина на сравнительно высоком уровне. Эти результаты показывают, что в клетках синхронно один транскрипт [βs] заменяется другим [β-глобин], за счет чего и достигается терапевтический эффект, так как фетальный у-глобин снижает уровень полимеризации βs-глобина в эритроцитах. Важным достоинством метода является возможность использования собственных клеток пациента, а не донорского материала.
Таким образом, авторы впервые показали осуществимость комбинированного терапевтического подхода генной и siRNA терапии на модели СКА с клетками человека. Терапевтические возможности РНК интерференции потенциально очень велики, несмотря на риск иммунного ответа и необходимость строгих условий выбора гена-мишени. В настоящее время ведутся работы по изучению транспорта РНК из клетки в клетку [6], опубликованы статьи об исследованиях РНК- интерференции в борьбе со СПИДом [7-9], гепатитом [10, 11] и раком [12-14]. Все это дает надежду на разработку нового, более эффективного метода [чем обычная генная или клеточная терапия] в биомедицине. Тем не менее, метод может иметь и ряд недостатков - нарушение естественного хода трансляции, иммунный ответ, неспецифическое подавление экспрессии [15, 16]. Несомненно, развитие этого перспективного метода поможет решить некоторые из этих проблем.
Supplementary files
