CONSTRUCTING AND SELECTION OF RECOMBINANT SINGLE-CHAIN ANTIBODIES TO HEXOKINASE OF THE MICROSPORIDIUM NOSEMA BOMBYCIS

详细

全文:

Гексокиназа - ключевой фермент углеводного обмена, осуществляющий фосфорилирование гексоз и запускающий анаэробное расщепление глюкозы в ходе гликолиза. Гексокиназа внутриклеточных паразитических микроорганизмов, относящихся к типу Microsporidia обладает уникальными свойствами, предполагающими ее активное участие в регуляции транскрипционной активности генов хозяина: (1) сохранение в геноме паразитов при утрате других компонентов гликолиза, (2) экспрессия уже на ранних этапах внутриклеточного развития микроспоридий, (3) интенсивная секреция в цитоплазму хозяина, (4) накопление в ядрах зараженных клеток. Гетерологичная экспрессия гексокиназы микроспоридии Nosema bombycis (высоковирулентного паразита шелковичного червя Bombyx mori) с использованием вектора pOPE101 и бактериального штамма Escherichia coli XL-1Blue MRF’ позволила получить очищенный фермент в активной конформации, кинетические характеристики которого были сопоставимы с таковыми у других организмов. Очищенный фермент микроспоридий был использован для конструирования иммунной библиотеки рекомбинантных одноцепочечных антител (scFv-фрагментов) и отбора вариантов, специфичных к нативной форме гексокиназы. Конструирование иммунной библиотеки осуществлялось с использованием РНК, выделенной из селезенки предварительно иммунизированных мышей с последующим синтезом кДНК и ПЦР-амплификацией всех возможных вариантов генов вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей IgG. Полученный репертуар генов VH/VL-фрагментов был клонирован в фагемидный вектор pSEX81. Разнообразие конечной библиотеки после трансформации штамма E. coli XL-1Blue MRF’ полученными конструкциями составило около 5 млн индивидуальных клонов. Для отбора специфичных антител была использована технология фагового дисплея, основанная на том, что бактериофаги M13, несущие различные варианты сконструированных фагемид, экспонируют кодируемые ими scFv-антитела на своей поверхности. После проведения двух раундов селекции бактериофагов, несущих антитела против иммобилизованной гексокиназы, отобранные гены были переклонированы в экспрессирующий вектор pOPE101 для последующей наработки scFv-молекул в E. coli. Анализ scFv-фрагментов, продуцируемых двумя сотнями бактерий-трансформантов, позволил уже на данном этапе отобрать три варианта антител с разной антиген-связывающей активностью. Идентичность их аминокислотных последовательностей составила 33-50%. Внутри двух групп scFv-антител была обнаружена внутренняя гетерогенность (2 и 5 вариантов, соответственно, с идентичностью 93-94%). Полученные антитела позволяют перейти к работе по оценке их способности ингибировать активность гексокиназы, нарушать ее транспорт в ядро клетки-хозяина и подавлять внутриклеточное развитие микроспоридии N. bombycis.