Vaginal microbiocenosis in patients with HPV-associated and HPV-negative cervical intraepithelial neoplasias

Full Text

Хроническое воспаление является одним из этиологических факторов развития опухолевых и предопухолевых заболеваний цервикального эпителия [1, 2]. В настоящее время установлена корреляция между бактериальным вагинозом (БВ) и персистенцией вируса папилломы человека (ВПЧ) в цервикальном канале [3, 4]. Показано, что повышение рН влагалища способствует увеличению риска инфицирования несколькими типами ВПЧ и развитию LSIL у женщин в возрасте до 35 и старше 65 лет [5]. По данным зарубежных исследователей, БВ является одним из кофакторов возникновения цервикальных неоплазий [6-8]. При этом, по данным J.M. Klomp и соавт. [9], среди анаэробов при цервикальных неоплазиях наиболее часто встречается Gardnerella vaginalis. Поскольку условно-патогенные бактерии при достижении ими высоких концентраций во влагалище и шейке матки обладают потенциальной способностью вызывать и поддерживать диспластический процесс [8, 10], изучение вагинальной микрофлоры при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и персистенции ВПЧ является важным для понимания механизмов опухолевой трансформации цервикального эпителия [11-13]. Внедрение современных молекулярно-биологических методов диагностики позволило существенно расширить представление о видовом составе условно-патогенных микроорганизмов, обитающих во влагалище. Качественная и количественная оценка основных значимых участников вагинального микробиоценоза создает предпосылки для разработки дифференцированного подхода к терапии выявленных дисбиотических нарушений у пациенток с цервикальными неоплазиями перед проведением деструкции. Цель исследования - изучить качественный и количественный состав микробиоценоза влагалища у пациенток с цервикальными интраэпителиальными нео- плазиями (CIN). Материал и методы Проведено клинико-лабораторное обследование 311 пациенток с гистологически подтвержденными CIN. Всем пациенткам выполнен необходимый диагностический стандарт: осмотр в зеркалах и бимануально, цитологическое исследование мазков с экто- и эндоцервикса, полимеразная цепная реакция (ПЦР) на ВПЧ, расширенная кольпоскопия, гистологическое исследование биоптатов шейки матки. Материал для исследования микробиоценоза влагалища собирали с заднебоковой стенки влагалища, для выявления ВПЧ - из цервикального канала. Соскоб помещали в пробирку Эппендорф, содержащую 1 мл физиологического раствора, хранение и транспортировку материала проводили согласно действующим нормативным документам. ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов ПРОБА-ГС (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва). Исследование проводили методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием реагентов Фемофлор-16 (ООО «НПО ДНК-Технология») в детектирующем ам- плификаторе ДТ-96, согласно инструкции производителя (ООО «НПО ДНК-Технология»), в лаборатории ООО МФЦ «Гармония» (Екатеринбург). Микробиоценоз влагалища оценивали согласно предложенной ранее классификации [14]. Вариант микробиоценоза, при котором доля нормофлоры более 80%, а количество Ureaplasma spp., Mycoplasma spp., Candida spp. менее 104 ГЭ/мл, расценивали как абсолютный нормоценоз, а при содержании Ureaplasma spp., Mycoplasma spp., Candida spp. более 104 ГЭ/мл - как условный нормоценоз. Вариант микробиоценоза, при котором доля нормофлоры составляла 20-80% всей микрофлоры, расценивали как умеренный (аэробный или анаэробный) дисбиоз, а при снижении ее содержания ниже 20% - как выраженный дисбиоз. При этих состояниях доля условно-патогенной микрофлоры (факультативных или облигатных анаэробов) составляла 20% и более [8]. Выявление ВПЧ проводили методом ПЦР-РВ с использованием реагентов и оборудования ООО «НПО ДНК-Технология». В соответствии с результатами гистологического исследования и тестирования на ВПЧ все обследованные пациентки были разделены на 3 группы: 1-ю группу составили 100 ВПЧ-негативных пациенток с LSIL, во 2-ю группу вошли 109 ВПЧ-позитивных пациенток с LSIL, 3-ю группу составили 102 пациентки с гистологически подтвержденным диагнозом HSIL, все пациентки данной группы были ВПЧ-позитивными. В контрольную группу вошли 102 женщины с визуально не измененной шейкой матки и отсутствием ВПЧ по данным ПЦР-РВ, обратившиеся в женскую консультацию для профилактического обследования. Включенные в исследование пациентки основных и контрольной групп были сопоставимы по возрасту, паритету. Средний возраст всех обследованных женщин составил 32 ± 3,2 года. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета SPSS Statistics версии 20.0. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков была выбрана медиана Me, а в качестве интервальной оценки - 25-й и 75-й квартили, так как исследуемые выборки не подчинялись закону нормального распределения. Достоверность различий проверяли с помощью двустороннего критерия Фишера (при сравнении данных по частоте выявления) и критерия Манна-Уитни (для сравнения средних значений) при уровне значимости (а) 0,05. Результаты и обсуждение При анализе структуры микробиоценоза влагалища были выявлены существенные различия между группами обследованных женщин в зависимости от состояния эпителия шейки матки и инфицированности ВПЧ. У 98% клинически здоровых женщин (4-я группа) состояние вагинальной микробиоты, по данным ПЦР-РВ, соответствовало критериям нормоценоза; в том числе у 69 (67,6%) пациенток был выявлен абсолютный нормо- ценоз, у 31 (30,4%) - условный нормоценоз, обусловленный присутствием Ureaplasma spp. и Candida spp. в количестве более 104 ГЭ/мл. Дисбиоз, по данным ПЦР- РВ, был определен только у 2 женщин. У пациенток 1-й группы (LSIL, ВПЧ-негативные) нормоценоз выявляли статистически значимо реже, чем в контрольной группе: критериям абсолютного нормоценоза соответствовал состав микробиоты у 41 (41%), а условного нормоценоза - у 33 (33%) обследованных. У 26 (26%) пациенток состояние микробиоценоза соответствовало критериям дисбиоза, в том числе умеренного - у 9%, выраженного - у 17%. Структура микробиоценоза влагалища у пациенток 2-й группы (LSIL, ВПЧ-позитивные) значимо не отличалась от показателей 1-й группы. Таким образом, у женщин с LSIL, вне зависимости от наличия ВПЧ, дисбиотиче- ские нарушения встречались статистически значимо чаще, чем в контрольной группе. С одной стороны, данное наблюдение может указывать на значимость нарушений микробиоценоза влагалища в возникновении диспластических поражений шейки матки на начальном этапе даже без влияния вируса. С другой стороны, невозможно исключить, что ВПЧ-негативные на момент обследования пациентки были инфицированы вирусом в прошлом, что стало пусковым моментом для развития дисплазии. В случае последующей самопроизвольной элиминации ВПЧ вирус, естественно, не может быть определен в настоящее время, а сопутствующий дисбиотический процесс способствует сохранению изменений в клетках эпителия, характерных для LSIL. Таблица 1. Структура микробиоценоза влагалища у пациенток с CIN и клинически здоровых женщин, абс. (%) Вид биоценоза 1-я группа (LSIL, ВПЧ-; n = 100) 2-я группа (LSIL, ВПЧ+; n = 109) 3-я группа (HSIL; n = 102) 4-я группа (норма; n = 102) Абсолютный нормоценоз 41 (41ae) 41 (37,6bf) 10 (9,8ecf) 69 (67,6ac) Условный нормоценоз 33 (33e) 34 (31,2bf) 16 (15,7ecf) 31 (30,4) Умеренный дисбиоз 9 (9a) 12 (11,1b) 16 (15,7c) 1 (1,0abc) Выраженный дисбиоз 17 (17ae) 22 (20,1bf) 60 (58,8ecf) 1 (1,0abc) Таблица 2. Количественный состав микробиоценоза влагалища у женщин с цервикальными неоплазиями, абс. (%) Количество микрорганизмов, Ме (25-75 процентиль), 1дГЭ/мл Показатель 1-я группа (LSIL, ВПЧ-; n = 100) 2-я группа (LSIL, ВПЧ+; n = 109) 3-я группа (HSIL; n = 102) 4-я группа (норма; n = 102) Общая бактериальная масса 7,6 (7,2-7,9)de 7,7 (7,4-8,2)df Нормофлора 8,0 (7,4-8,4)ef 7,8 (7,3-8,1) Lactobacillus spp. 7,5 (6,8-7,8)ae 7,6 (7,1-8,0)f 7,0 (5,3-7,6)cef 7,8 (7,3-8,1)ac Факультативно-анаэробные (аэробные) микроорганизмы Enterobacteriaceae spp. 3,1 (2,6-3,4) 2,9 (2,5-3,3) 3,1 (2,6-3,5)c 2,8 (2,4-3,2)c Streptococcus spp. 2,6 (1,7-3,6)a 2,5 (1,9-3,7)b 2,5 (2,1-3,9)c 2,1 (1,6-3,1)abc Staphylococcus spp. 3,0 (2,0-3,5) 2,9 (2,3-3,6) 3,1 (2,3-4,0) c 2,9 (2,4-3,5) c Облигатно-анаэробные микроорганизмы Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. 4,5 (3,5-6,1)ae 3,9 (3,2-6,2)bf 7,2 (6,1-7,6)cef 3,5 (3,1-4,3)abc Eubacterium spp. 4,5 (3,6-5,7)ae 4,4 (3,2-5,7)bf 6,4 (5,5-6,8)cef 3,6 (3,1-4,8)abc Sneathia spp./Leptotrihia spp./ Fusobacterium 2,1 (0-3,3)e 2,1 (1,4-2,9)f 3,4 (2,1-6,9)cef 2,0 (1,3-2,6)c Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. 3,5 (2,6-4,7)ae 3,3 (2,3-4,8)bf 5,8 (4,1-7,2)cef 3,0 (2,3-3,8)abc Lachnobacterium spp./ Clostridium spp. 3,4 (2,2-4,4)ae 2,8 (2,2-4,1)f 4,1 (2,9-5,1)cef 2,7 (2,2-3,5)ac Mobiluncus spp./ Corynebacterium spp. 3,5 (2,8-4,1)ade 3,1 (2,5-3,9)df 3,9 (3,0-4,6)cef 3,1 (2,5-3,8)ac Peptostreptococcus spp. 3,3 (2,3-4,4)ae 2,9 (2,3-4,0)bf 4,4 (2,9-6,2)cef 2,6 (2,2-3,3)abc Atopobium vaginae 3,1 (2,6-5,1)ade 2,5 (2,0-3,8)df Микоплазмы 6,6 (2,8-7,5)cef 2,5 (2,0-3,1)ac Mycoplasma hominis 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) Mycoplasma genitalium 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) 0 (0,0-0,0) Ureaplasma (urealyticum+parvum) 3,0 (0,0-4,2)a 1,7 (0,0-4,8) 2,9 (0,0-4,9)c 1,3 (0,0-3,8)ac Дрожжеподобные грибы Candida spp. 2,7 (2,4-3,3) 2,6 (2,4-2,9) 2,6 (2,4-3,0) 2,5 (2,3-2,8) Примечание. Уровень значимости а = 0,05. Примечание. Здесь и в табл. 2: ВПЧ ВПЧ-негативные, ВПЧ+ - ВПЧ-позитивные; статистически значимые различия: a - между 1-й и 4-й группами, b - между 2-й и 4-й, с - между 3-й и 4-й, d - между 1-й и 2-й, e - между 1-й и 3-й, f - между 2-й и 3-й. Среди пациенток 3-й группы (HSIL) нормоценоз выявили только у каждой 4-й, в том числе абсолютный нормоценоз - у 9 (9,8%), условный - у 16 (15,7%) обследованных. У большинства женщин с HSIL состояние вагинальной микробиоты соответствовало критериям дисбиоза, в том числе выраженный дисбиоз выявлен у 60 (58,8%) обследованных. Частота выявления дисбиоза у пациенток 3-й группы была статистически значимо выше, чем у условно здоровых женщин (4-я группа), а также у пациенток с LSIL (1-я и 2-я группы), что может свидетельствовать в пользу теории о роли вирусно-бактериальных ассоциаций в прогрессировании диспластического процесса в шейке матки [15] (табл. 1). В структуре выраженных дисбиозов у пациенток 1, 2 и 3-й групп преобладал анаэробный дисбиоз - 8 (52,9%), 15 (68,2%) и 45 (75,0%) случаев соответственно, аэробный дисбиоз выявляли значительно реже - у 3 (11,7%), 4 (18,2%), и 8 (13,3%) женщин соответственно. У 6 (35,3%), 3 (13,6%) и 7 (11,7%) пациенток соответственно диагностировали смешанный аэробно-анаэробный дисбиоз. Полученные данные вполне согласуются с результатами ранее выпоненных исследований, указывающих на наличие корреляции между CIN и БВ [8, 10]. Уровень общей бактериальной массы вагинального биотопа был наиболее высоким у пациенток 3-й группы - 108 ГЭ/мл, при этом количество лактофлоры оказалось статистически значимо ниже, чем у женщин группы сравнения (4-я группа) и пациенток 1-й и 2-й групп (табл. 2). Кроме того, у пациенток 3-й группы статистически значимо выше было абсолютное содержание облигатных и факультативных анаэробов по сравнению как с показателями женщин 4-й группы (норма), так и 1-й, 2-й групп. Особое внимание следует обратить на микроорганизмы групп Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Atopobium vaginae, Eubacterium spp. и Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., количество которых в 1000-10 000 раз превышало таковое у пациенток других групп и составило 1072, 1066, 1064 и 1058 ГЭ/мл соответственно. Количество облигатных анаэробов у пациенток 3-й группы также было значительно увеличено по сравнению с нормой (4-я группа), однако превышение было в пределах 10-100 раз. Также было отмечено статистически значимое увеличение количества факультативных анаэробов у пациенток с HSIL по сравнению с группой сравнения, однако разница с аналогичными показателями была умеренная и не превышала один порядок (10 раз). Таким образом, качественный и количественный состав микробиоценоза влагалища у пациенток с дисплазией шейки матки и у здоровых женщин значительно различается. Полученные данные указывают на взаимосвязь между тяжестью дисплазии и степенью дисбиоза у пациенток с патологией шейки матки: для пациенток с HSIL характерны более выраженные изменения в количестве и составе вагинальной микрофлоры с доминированием облигатных анаэробов по сравнению с LSIL. Остается открытым вопрос, что первично в данном случае: является ли дисбиотический процесс во влагалище фактором, способствующим формированию более выраженных патоморфологических изменений в цервикальном эпителии, инфицированном ВПЧ, или персистенция ВПЧ создает благоприятный фон для пролиферации условно-патогенной облигатноанаэробной микрофлоры во влагалище с развитием тяжелого дисбиоза. Учитывая высокую частоту дисбио- тических нарушений у пациенток с патологией шейки матки, особенно с HSIL, целесообразно проводить комплексное исследование вагинальной микробиоты и при необходимости индивидуальную коррекцию дисбиоза данной категории больных. Выводы 1. Развитие цервикальных интраэпителиальных неоплазий у ВПЧ-негативных женщин сопровождается нарушением микробиоценоза влагалища. При этом имеет значение как анаэробный, так и смешанный аэробно-анаэробный дисбиоз. Среди анаэробов чаще всего выявляли Gardnerella vaginalis в ассоциации с Eubacterium spp., Megasphaera spp. иMobiluncus spp. 2. ВПЧ-ассоциированные цервикальные неоплазии сопровождаются развитием выраженных дисбиоти- ческих процессов во влагалище с преимущественным участием облигатных анаэробов. Среди анаэробов наибольшее значение имеют Gardnerella vaginalis в ассоциации с Atopobium vaginae, Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. и Eubacterium spp. 3. Разнообразие лидирующих возбудителей диктует необходимость комплексного исследования микробиоценоза влагалища у пациенток с предраковой патологией шейки матки, позволяющего с высокой точностью и специфичностью дать количественную и качественную оценку основных участников исследуемого биотопа для назначения индивидуальной терапии.

About the authors

I. N Kononova

Ural State Medical University

Ekaterinburg, Russian Federation, 620028

E. S Voroshilina

Ural State Medical University; Harmony Center

Email: voroshilina@gmail.com
Ekaterinburg, Russian Federation, 620028

D. L Zornikov

Ural State Medical University

Ekaterinburg, Russian Federation, 620028

A. G Malygin

Ural State Medical University

Ekaterinburg, Russian Federation, 620028

References

Supplementary files