NAT2, GST T1, and GST M1 gene polymorphisms in women with pelvic organ prolapse and stress urinary incontinence

Full Text

Данные современных исследований позволяют с уве- ения соединительной ткани (СТ) играют важную роль ренностью полагать, что врожденные особенности стро- в этиологии таких заболеваний, как пролапс тазовых Таблица 2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для проведения ПЦР Ген Полиморфизм Структура олигопраймеров GST M1 Делеция F GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C R GTT GGG CTC AAA TAT AGG GTG G GST T1 Делеция F TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC R TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA NAT2 Полиморфизм C481T(S1), G590A(S2), G857A(S3) F GCT GGG TCT GGA AGC TCC TC R TTG GGT GAT ACA TAC ACA AGG G органов (ПТО) и стрессовое недержание мочи (СНМ) у женщин, являясь следствием системной дисплазии соединительной ткани (ДСТ) [1]. В то же время эндогенные патогенетические механизмы декомпенсации эластических свойств тканей тазового дна изучены неполностью. Известно, что подверженность человека различным заболеваниям может определяться так называемыми генами предрасположенности [2]. В ряде исследований показано, что полиморфизм генов, определяющих синтез коллагена, ферментов деградации коллагена, в частности семейства металлопротеиназ (ММР-1, MMP- 2, MMP-9), ассоциирован с риском развития ПТО и СНМ [3-6]. Согласно современным представлениям, основными ферментами биосинтеза СТ являются лизилоксида- за и N-ацетилтрансфераза. Также показано, что структурно и (или) функционально неполноценные компоненты СТ при ее дисплазии в большей степени, чем здоровые ткани, подвержены воздействию оксидатив- ного стресса [7]. Можно предполагать, что особенности ферментных систем, участвующих в процессах инактивации свободных радикалов вовлечены в патогенез ПТО и СНМ. Для проверки этого предположения целесообразно изучение полиморфизма генов, кодирующих ферменты семейства глутатион^-трансферазы (GSTs) и N-ацетилтрансферазы. Цель исследования - изучить особенности полиморфизмов генов N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2), глу- татион^-трансферазы Т1 (GST T1 (del)), глутатион-S- трансферазы М1 (GSTMl (del)) у больных с ПТО и СНМ. Материал и методы В основные группы исследования вошли 130 пациенток: 67 женщин с ПТО (1-я группа) и 63 женщины с ПТО и СНМ (2-я группа) - представительницы европеоидной расы, проживающие в Северо-Западном регионе России. Средний возраст больных в указанных группах составил 65,5 ± 5,8 и 66,6 ± 6,8 года соответственно. Результаты объективного обследования состояния тазового дна пациенток представлены в табл. 1. Группа сравнения (п = 89) представляла собой популяционную выборку женщин, не имевших на момент исследования клинических признаков ПТО и недержания мочи и проживавших в Северо-Западном регионе России. Генетическое исследование Образцы ДНК, полученные стандартным методом из лимфоцитов периферической крови, использованы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР с анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) генов NAT2, GST T1 и GST Ml. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис- HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Taq- ДНК-полимеразы. Олигонуклеотидные прайме - Таблица 1 . Стадии ПТО у обследованных больных основных групп (п = 130) Стадия ПТО (POPQ) 1-я группа (п = 67), абс. (%) 2-я группа (п = 63), абс. (%) I 17 (25,4) 8 (12,7) II 16 (23,9) 11 (17,5) III 12 (17,9) 15 (23,8) IV 23 (34,3) 29 (46) ры, используемые для ПЦР, представлены в табл. 2. Для амплификации применяли программируемый термоциклер «ДНК-технология» (Москва). После окончания ПЦР специфичность амплификации и количество амплификата определяли методом электрофореза в 7,0% полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма гена NAT2 Для ПЦР-анализа фрагмента гена NAT2 после денатурации (94 оС, 7 мин) проводили 32 цикла амплификации в режиме: 94 оС - 1 мин; 53 оС - 1 мин; 72 оС - 1 мин 20 с, с заключительным синтезом 5 мин при 72 оС. При идентификации полиморфных аллелей гена NAT2 проводили расщепление полученного ПЦР продукта ре- стриктазами Kpn1, Taq1, BamH1. Замена C481T (аллель S1) разрушает сайт рестрикции для эндонуклеазы Kpn1, замена G590A (аллель S2) - для эндонуклеазы Taq1, замена G857A (аллель S3) - для эндонуклеазы BamH1. Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7,5% ПААГ с окраской этидиумбромидом и визуализацией в УФ-свете. Генотип ацетилирования определяли по 3 наиболее распространенным в европейской популяции сайтовым полиморфизмам: C481T(S1), G590A(S2), G857A(S3). Аллель дикого типа (без мутаций) (N) - NAT2*4 - соответствует фенотипу быстрого ацетилирования. Аллели NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7, имеющие по одному полиморфизму в сайтах C481T, G590A, G857A, ассоциированы с медленным ацетилированием [8]. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов GST T1 и GSTM1 Для амплификации фрагментов генов GST M1 и GST T1 использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (при 94 оС 7 мин) проводили 30 циклов ампли- Количество пациенток Показатель группа сравнения 1-я группа 2-я группа р абс. % абс. % абс. % Генотипы N/N 14 15,7 2 2,9 3 4,8 p = 0,02 1-2 p = 0,04 1- 3 р > 0,05 2- 3 S1/N 14 15,7 13 19,4 16 25,8 р > 0,05 1-2-3 S2/N 18 20,2 12 17,9 14 22,6 р > 0,05 1-2-3 S3/N 1 1,2 2 2,9 1 1,6 р > 0,05 1-2-3 S1/S1 18 20,2 14 20,9 12 19,4 р > 0,05 1-2-3 S1/S2 17 19,1 14 20,9 10 16,1 р > 0,05 1-2-3 S1/S3 - - 3 4,5 0 0 р > 0,05 1-2-3 S2/S2 6 6,7 6 9 6 9,7 р > 0,05 1-2-3 S2/S3 1 1,2 1 1,5 0 0 р > 0,05 1-2-3 Итого ... 89 100 67 100 Аллели 62 100 N 61 34,3 31 23,1 37 29,8 p = 0,04, p1-2 > 0,05 1- 3 р > 0,05 2- 3 S1 67 37,6 58 43,2 50 40,3 р > 0,05 1-2-3 S2 48 27,0 39 29,1 36 29 р > 0,05 1-2-3 S3 2 1,1 6 4,5 1 0,8 р > 0,05 1-2-3 Всего ... 178 100 134 100 124 100 Таблица 3. Распределение частот аллелей и генотипов по гену NAT2 у пациенток и в группе сравнения Выявлены достоверные различия между основными группами и группой сравнения по распределению генотипов N/N. Гомози - готное состояние по аллелю N гена NAT2 в группе больных с ПТО и недержанием мочи встречалось достоверно реже (4,8%), чем в группе сравнения (15,7%, р = 0,04), так же как и в группе с ПТО без СНМ (2,9%, р = 0,02). Генотип N/N был выявлен только у 3 пациенток с ПТО I стадии и недержанием мочи и не встречался у женщин с более выраженными стадиями пролапса (II-IV). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, N/N-генотип снижает вероятность ПТО приблизительно в 5,4 раза (OR = 6,1, 95% CI 1,33-27,7) и вероятность ПТО + СНМ приблизительно в 3,7 раза (OR=3,67, 95% CI 1,01-13,38). Частота генотипов по генам GST T1 и GST Ml (GSTs) у пациенток основных групп и в группе сравнения представлены в табл. 4. При анализе распределения генотипов GST M1 выявлено достоверное преобладание GST М1 del-генотипа в группе пациенток с ПТО и СНМ по сравнению с контрольной группой. Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, наличие генотипа GST М1 del повышает вероятность развития ПТО и СНМ приблизительно в 1,5 раза (OR = 1,49, 95% CI 1,04-2,15). При этом достоверных различий по полиморфизму данного гена между группой больных с ПТО без недержания мочи и контрольной группой не выявлено. Во всех группах обнаружено одинаковое распределение генотипов GST T1 с преобладанием GST T1+- генотипа. Достоверных различий между группами не выявлено. Результаты анализа частоты сочетания генотипов по генам GST T1 и GST М1 в основных группах и в контрольной группе представлены в табл. 5. фикации в режиме: 94 оС - 40 с, 59 оС - 40 с, 72 оС - 1 мин, с заключительным синтезом 5 мин при 72 оС. Наличие на электрофореграммах продуктов амплификации размерами 315 пар оснований (п.о.) (для GST Т1) и 271 п.о. (для GSTM1) соответствовало гомозиготам по аллелям «дикого» типа соответствующих генов, отсутствие продуктов амплификации - гомозиготам по «нулевым» аллелям этих генов. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена GST Р1 (192 п.о.). Гетерозиготные носители - «нулевой» аллель/« дикий» аллель - не дискриминировались. Статистическую обработку данных проводили методами описательной статистики и сравнения выборок с использованием /-критерия Стьюдента, точного критерия Фишера, критерия %2 с поправкой Йетса, коэффициента соотношения шансов (OR). Уро - вень статистической значимости (р) принят < 0,05. Обрабатывали данные с использованием программ Instat и Statistica (версия 6). Результаты и обсуждение Частота аллелей и генотипов гена NAT2 в исследуемых группах пациенток и в группе сравнения представлены в табл. 3. Количество пациенток Генотип группа сравнения 1-я группа 2-я группа р абс. % абс. % абс. % GST T1 + 50 80,6 46 68,7 48 76,2 р > 0,05 1-2-3 GST T1 del 12 19,4 21 31,3 15 23,8 р > 0,05 1-2-3 Итого ... 62 100 67 100 63 100 GST М1 + 37 59,7 36 53,7 25 39,7 р > 0,05, p1-2 = 0,04, р1-3 > 0,05 2-3 GST М1 del 25 40,3 31 46,3 38 60,3 р > 0,05, p1-2 = 0,04, р1-3 > 0,05 2-3 Всего ... 62 100 67 100 63 100 Таблица 4. Распределение генотипов по генам GST T1 и GST M1 у пациенток основных групп и в группе сравнения Таблица 5. Частота сочетания генотипов по генам GST T1 и GST M1 в основных группах и в контрольной группе Количество пациенток Сочетание генотипов группа сравнения 1-я группа 2-я группа р абс. % абс % абс % del/del 6 9,7 12 17,9 8 12,7 р >0,05 1-2-3 del/GST M1 + 6 9,7 9 13,4 7 11,1 р >0,05 1-2-3 GST T1+/del 19 30,6 19 28,4 30 47,6 р >0,05, 1-2 p = 0,06 GST T1+ /GSTM1 + 31 50 27 40,3 18 28,6 р > 0,05 p 1-2= 0,02 1- 3 р > 0,05 2- 3 Всего ... 62 100 67 100 63 100 Как следует из табл. 5, частота комбинированного генотипа GST T1+/GST M1+ у пациенток с ПТО и СНМ была почти в 2 раза меньше, чем в группе сравнения (р = 0,02). Генотип GST T1+/GST M1+ снижает вероятность развития ПТО + СНМ в 2,5 раза (OR=2,5, 95% CI 1,19-2,24). Гистологические и иммуногистохимические исследования тканей тазового дна пациенток с ПТО и СНМ выявили патологические изменения соединительнотканных и мышечных компонентов, обусловливающие их несостоятельность [1, 9, 10]. Согласно современным представлениям, указанные изменения - форма проявления ДСТ [1, 11]. ДСТ - полиорганная или полиси- стемная патология с прогредиентным течением, в основе которой лежат дефекты синтеза или катаболизма компонентов внеклеточного матрикса или регуляторов морфогенеза СТ [12]. N-ацетилтрансфераза (NAT) - фермент, катализирующий реакцию переноса ацетильной группы с молекулы ацетилкоэнзима на аминогруппы различных субстратов, приводя к образованию полярных ацетильных конъюгатов. В структуре межклеточного матрикса СТ NAT осуществляет ацетилирование углеводных компонентов (D-галактозамина и D-глюкозамина) [13]. Существует 2 типа NAT - N-ацетилтрансфераза 1 и N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2), гены которых картированы в области 8p21,3-p23,1 [14]. Гены экспрессируются во многих тканях и особенно активно в клетках печени. Активность фермента генетически детерминирована, наследуется по аутосомно-доминантному типу и определяется наличием частого полиморфизма в гене NAT2, изменяющего функциональную активность белка. Носители аллеля N в гомо- или гетерозиготном состоянии являются «быстрыми ацетиляторами». Известно, что NAT2 имеет как прямое, так и опосредованное значение для метаболизма СТ. В условиях низкой активности фермента изменяются состав и пространственная структура протеин-полисахаридных комплексов, а также их взаимосвязь с волокнами СТ. С другой стороны, неметаболизированные субстраты NAT2 способны блокировать медьзависимую лизилок- сидазу - фермент, основной функцией которого является стабилизация структуры коллагена и эластина в СТ [15]. В литературе имеются данные о роли NAT2 в развитии многих заболеваний, в том числе гинекологических. Высокая активность этого фермента ассоциируется с миомой матки и спаечной болезнью [16]. Также установлено, что «медленные ацетиляторы» преобладают среди больных с ПТО. Показано, что наличие генотипа, определяющего медленный тип ацетилирования, повышает вероятность развития ПТО приблизительно в 2 раза (OR = 2,01, CI 1,05-3,84) [17]. В настоящем исследовании выявлено достоверное уменьшение количества женщин с функционально активным генотипом N/N в группах больных с ПТО, а также при сочетании ПТО и СНМ, что подтверждает наличие общих патогенетических механизмов в развитии этих заболеваний. Глутатион^-трансферазы - семейство многофункциональных ферментов фазы II системы детоксикации. Ферменты катализируют присоединение глутатиона, основного клеточного антиоксиданта, к электрофильно- му центру ряда органических веществ, что приводит к образованию менее токсичных гидрофильных соединений. Кроме того, GSTs являются важным компонентом глутатионзависимого звена антиоксидантной системы. GSTs связывает глутатион со свободными радикалами и ксенобиотиками, повреждающими мембранные структуры клеток [18]. Результатом гомозиготной делеции в генах GSTs является отсутствие соответствующих белковых продуктов, что определяет повышенную индивидуальную чувствительность к воздействиям факторов внешней среды и эндогенных факторов. В частности, полиморфизм генов семейства GSTs определяет подверженность клеток к патологическому перекисному окислению мембранных липидов в условиях оксидативного стресса. Возможно, что повреждение клеток СТ способно приводить к нарушению клеточно-матриксного взаимодействия и соответственно к декомпенсации механических свойств СТ [19]. В клиническом плане наибольший интерес представляет полиморфизм 2 классов семейства GSTs: mu (GST M1) и theta (GST T1). Гены GST М1 и GST Т1 картированы соответственно на хромосомах 1p13.3 и 22q11.23 [2]. Ранее нами выявлена высокая частота «нулевых» генотипов GST T1 и GST М1 у больных с тяжелыми формами и рецидивами ПТО [20]. Это свидетельствует о том, что генетически детерминированная низкая активность данных ферментов может способствовать прогрессированию ПТО и низкой эффективности его оперативной коррекции. В настоящем исследовании отмечено достоверное различие в частоте сочетанных генотипов GST T1/GST M1 у пациенток с ПТО и СНМ по сравнению с контрольной группой, что выражалось в снижении частоты встречаемости сочетанного генотипа GST T1/GST M1 +/+ при заболевании (р = 0,02). Обнаружено также достоверное преобладание генотипа GSTМ1 del в группе пациенток с ПТО и СНМ по сравнению с контрольной группой. При этом достоверных различий в частоте полиморфизма данных генов у больных с ПТО без недержания мочи и контрольной группой не выявлено. Учитывая ранее полученные данные о корреляции полиморфизма GST T1/GST M1 с прогрессированием ПТО, можно рассматривать развитие СНМ у больных с ПТО как проявление сочетанной патологии соединительнотканных структур тазового дна. Заключение Полученные данные анализа полиморфизма генов подтверждают гипотезу о роли наследственной ДСТ в этиологии и патогенезе ПТО и СНМ. Одним из эндогенных факторов, способствующих формированию и прогрессированию ПТО и СНМ, является мутация генов фазы II системы детоксикации (NAT2, GST Т1 и GSTМ1). Генотип NAT2 N/N снижает вероятность развития ПТО и СНМ приблизительно в 3,7 раза (OR = 3,67, 95% CI 1,01-13,38). Сочетанный генотип GST T1/GST M1 уменьшает вероятность развития ПТО в сочетании с СНМ в 2,5 раза (OR = 2,5, 95% CI 1,19-2,24). Наличие генотипа GST М1 del повышает вероятность развития ПТО и СНМ приблизительно в 1,5 раза (OR = 1,49, 95% CI 1,04-2,15). Изучение полиморфизма генов системы детоксикации важно для понимания патогенеза ПТО и СНМ, позволяет выявлять группы риска по развитию данной патологии, прогнозировать клиническое течение заболевания, а также оптимизировать методы профилактики и оперативного лечения.

About the authors

E. I Rusina

D.O. Ott Institute of Obstetrics and Gynecology

Email: pismo_rusina@mail.ru
St. Petersburg, Russian Federation, 199034

V. F Bezhenar

D.O. Ott Institute of Obstetrics and Gynecology

St. Petersburg, Russian Federation, 199034

T. E Ivashchenko

D.O. Ott Institute of Obstetrics and Gynecology

St. Petersburg, Russian Federation, 199034

V. S Pakin

D.O. Ott Institute of Obstetrics and Gynecology

St. Petersburg, Russian Federation, 199034

V. S Baranov

D.O. Ott Institute of Obstetrics and Gynecology

St. Petersburg, Russian Federation, 199034

References

Supplementary files