ANTIOXIDANT STATUS OF THE FOLLICULAR LIQUID AND ITS RELATION WITH THE QUALITY OF EMBRYON IN INFERTILITY PATIENTS PASSING THROUGH THE PROCEDURE OF EXTRACORPORAL FERTILIZATION

Full Text

Введение В современной науке актуальным является вопрос об участии активных форм кислорода (АФК) в различных физиологических и патологических процессах, протекающих в организме. Обнаружена роль АФК в функционировании многих систем органов, в том числе репродуктивной. С начала 2000-х годов начали появляться работы, в которых предпринимаются попытки найти корреляцию между антиоксидантным статусом фолликулярной жидкости (ФЖ) и исходом процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Эти исследования представляют интерес для клинической медицины, так как использование вспомогательных репродуктивных технологий получило в последние годы широкое распространение. Однако накопленные к настоящему времени экспериментальные данные неполны и во многом противоречат друг другу, поэтому изучение антиоксидантного статуса ФЖ при ЭКО должно быть продолжено. Фолликулярная жидкость заполняет полость преовуляторного фолликула и представляет собой транссудат плазмы с содержащимися в нем секретами фолликулярных клеток. По данным различных авторов, в состав ФЖ входят стероидные гормоны, цитокины, ферменты, антикоагулянты, электролиты, метаболиты (аминокислоты, жирные кислоты, липиды), факторы роста, источники АФК, ферментные и неферментные антиоксиданты [1]. В ней также обнаруживают клетки гранулёзы (фолликулярные клетки) и лейкоциты, которые начинают мигрировать в фолликул в периовариальной фазе и частично попадают в образец в ходе пункции фолликула [2]. В числе возможных источников АФК в фолликулярной жидкости рассматривают гранулёзу, нейтрофилы, макрофаги, эндотелиоциты [3]. Главными источниками АФК в клетках гранулёзы считаются цепь электронного транспорта в митохондриях и сигнальный каскад скавенджер-рецептора LOX-1 для окисленных липопротеинов низкой плотности [4]. Недавно было показано наличие НАДФН-оксидаз типа NOX4 и NOX5 в клетках гранулёзы [5]. Кроме того, в них обнаружены NO-синтазы эндотелиального типа [6]. ФЖ образуется главным образом из плазмы и содержит похожий набор антиоксидантов: супероксиддисмутазу (СОД), каталазу, селензависимую глутатионпероксидазу и глутатионредуктазу, а также жиро- и водорастворимые антиоксиданты, такие как витамин А, С, Е и глутатион [7-10]. Данные, имеющиеся в литературе, касаются роли прооксидантного статуса ФЖ в исходе ЭКО и представляют трудность для сопоставления и осмысления. Это связано с тем, что на результат процедуры, как и на состав ФЖ, влияют такие параметры, как возраст пациенток [8, 11, 12], причина бесплодия [13, 14], наличие или отсутствие гормонального вмешательства (ЭКО в стимулированном или естественном цикле) [3, 15, 16], а также образ жизни пациенток [11]. Кроме того, имеют значение параметры, выбираемые исследователями (например, оценка общего статуса или содержания отдельных антиоксидантов и др.) [17]. Некоторые исследователи пришли к выводу, что роль окислителей может отличаться на разных этапах репродуктивного цикла и развития эмбриона [17]. Недавно разработан новый метод анализа антиоксидантных свойств плазмы крови, основанный на кинетической хемилюминесценции, позволяющий описать антиоксидантные свойства несколькими показателями [18]. В связи с этим целью данной работы стали адаптация разработанного метода, определение антиоксидантного статуса фолликулярной жидкости и оценка антиоксидантных свойств фолликулярной жидкости новым хемилюминесцентным методом у женщин со сниженным овариальным резервом и трубным фактором бесплодия, проходящих процедуру ЭКО, а также сопоставление полученных данных с качеством эмбриона. Материал и методы Образцы фолликулярной жидкости получали во время забора ооцитов у 16 женщин со сниженным овариальным резервом (СОР) и 16 женщин с трубно-перитонеальным фактором (ТПФ) бесплодия. Забор ооцитов проводился путём трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ. Пациентки в обеих группах были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела и протоколу гормональной стимуляции (короткий протокол). Средний возраст пациенток в группе с ТПФ составлял 31,6 ± 1,8 года и в группе СОР - 37,6 ± 2,7 года. Пациентки наблюдались в Центре планирования семьи и репродукции (Москва). Оценку качества эмбрионов осуществляли по классификации Gardner на 5-е сутки после оплодотворения: степень зрелости бластоцисты (1-6), внутриклеточная масса (A - плотно упакованная с большим количеством клеток, B - более свободная группировка среднего количества клеток, C - незначительное количество клеток), трофэктодермальный слой (A - много клеток, формирующих трофэктодерму, B - немного клеток, C - незначительное количество больших клеток). Определение антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической люминолактивированной хемилюминесценции Для оценки антиоксидантной активности фолликулярной жидкости использовали методику, основанную на подавлении хемилюминесценции (ХЛ). В качестве источника свободных радикалов в системе использовали диазосоединение 2,2’-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид - АБАП («Fluka», США). В качестве хемилюминесцентного зонда использовали люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид-3-аминофталевой кислоты, «Sigma-Aldrich»). Хемилюминесцентный анализ плазмы проводили на однокюветном хемилюминометре SmartLum 100 («ДИСофт», Россия). В микропробирку объёмом 1,5 мл помещали 50 мкл 50 мМ раствора АБАП и 20 мкл 0,1 мМ люминола. Смесь перемешивали в течение 2 мин на встряхивателе «Vortex yellow line tts2» при частоте 1400 об/мин и инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре. Образование свободных радикалов в системе инициировали добавлением в кювету 930 мкл нагретого (37°С) фосфатного буферного раствора (100 мМ KH2PO4, pH 7,4; «Sigma», США) к 70 мкл смеси АБАП и люминола. Помещали пробирку в кюветное отделение хемилюминометра. Регистрировали свечение до достижения стационарного уровня (I0) при 37°C, затем добавляли 10 мкл фолликулярной жидкости, предварительно разбавленной в 10 раз. После добавления пробы свечение прекращалось благодаря нейтрализации радикалов антиоксидантами фолликулярной жидкости. После расходования антиоксидантов свечение вновь нарастало и достигало нового стационарного уровня I (рис. 1). Общий объём пробы в кювете составлял 1 мл. В качестве аналитических сигналов использовали S (АОА) - площадь над кривой, «вырезаемая» антиоксидантами, и tgα - угол наклона восходящей части кривой, характеризующий антиоксидантную активность белковой части. Результаты и обсуждение Исследование антиоксидантных свойств фолликулярной жидкости На первом этапе исследования проводили адаптацию разработанного для плазмы крови метода к анализу фолликулярной жидкости. Выяснилось, что методика определения АОА может быть без изменений применена для анализа фолликулярной жидкости. Кинетическая кривая хемилюминесценции фолликулярной жидкости аналогична по виду кривой антиоксидантной активности плазмы крови. В ней присутствуют те же фазы: 1) фаза действия сильного антиоксиданта мочевой кислоты; 2) фаза действия антиоксидантов средней силы, которые представлены прежде всего альбумином (см. рис. 1). Активность сильных антиоксидантов может быть оценена по площади S, а антиоксидантная активность альбумина - по тангенсу угла наклона второй фазы восходящей части кривой. Для того чтобы оценить, действительно ли сильный антиоксидант представляет собой мочевую кислоту, в реакционную среду добавляли уриказу в количестве 144 Ед/мл. Такую активность ранее использовали для полной нейтрализации мочевой кислоты в плазме крови. Действительно, в присутствии уриказы исчезает фаза действия сильного антиоксиданта, который, по всей вероятности, является мочевой кислотой. Следовательно, как и в плазме крови, антиоксидантная активность фолликулярной жидкости обусловлена мочевой кислотой и альбумином (рис. 2). На рисунке приведены кинетические кривые развития ХЛ фолликулярной жидкости, фолликулярной жидкости в присутствии уриказы, а также контроль - ХЛ-система, в которую вносили фосфатный буферный раствор (без ФЖ). Анализ антиоксидантного статуса пациенток, проходящих процедуру ЭКО, и сопоставление результатов с качеством эмбриона При помощи этого метода были проанализированы 32 образца фолликулярной жидкости женщин обеих групп. Измеряли общую антиоксидантную активность и антиоксидантную активность в присутствии уриказы, отражающую вклад альбумина. Рассчитывали параметр S для общей АОА, который переводили в единицы концентрации аскорбиновой кислоты, а также S для варианта с уриказой. Данные приведены в таблице. В качестве наблюдения интересно отметить резко сниженную АОА фолликулярной жидкости фолликулов, не содержащих ооцит, у пациенток вне исследуемых групп со сниженным овариальным резервом и проходящим ЭКО в естественном цикле (рис. 3). Таких пациенток было три. Резко сниженная АОА свидетельствует о выраженном окислительном стрессе в фолликуле, в котором не произошло развитие ооцита. Проверка нормальности распределения по Шапиро-Уилку показала, что распределение данных в группе СОР не является нормальным (p = 0,004), в отличие от группы ТПФ (p = 0,34), поэтому для сравнения групп использовали непараметрический критерий. Сравнение общей АОА в двух группах по критерию Манна-Уитни показало, что различие статистически незначимо (p = 0,34), однако и медиана, и межквартильный размах в группе СОР сдвинуты в сторону меньших значений по сравнению с группой ТПФ, что может свидетельствовать об окислительном стрессе в фолликуле у женщин в этой группе. Возможно, значимые различия проявятся при увеличении численности групп. Сравнение белковой части АОА в двух группах по критерию Манна-Уитни показало, что различие также не было статистически значимым (p = 0,41). При сопоставлении данных по общей АОА с качеством эмбриона в объединённой выборке были выделены три группы пациенток, АОА у которых значимо различались: пациентки с низким качеством эмбриона и пониженной антиоксидантной активностью, АОА 11,4 ± 2,5 мМ аскорбата (n = 16); пациентки с эмбрионом хорошего качества, АОА 21,4 ± 3,8 мМ (n = 10); пациентки с низким качеством эмбриона и повышенной АОА: 33,7 ± 2,9 мМ (n = 6). Пониженная антиоксидантная активность свидетельствует о развитии локального окислительного стресса в фолликулах. Повышенная антиоксидантная активность свидетельствует о состоянии, которое мы предлагаем называть «антиоксидантным стрессом», поскольку в этих условиях также не происходит удовлетворительного развития эмбриона. Заключение Исходя из сопоставления АОА (в единицах аскорбата) с качеством эмбриона, можно предложить три области: 1) зона сниженной АОА (менее 15 мкМ, окислительный стресс) - у этих пациенток наблюдали эмбрионы плохого качества; 2) зона нормальной АОА (15-30 мкМ) - у пациенток получены эмбрионы хорошего качества; 3) зона повышенной АОА (более 30 мкМ, антиоксидантный стресс) - у пациенток получены эмбрионы плохого качества. Таким образом, можно предположить, что для успешного развития эмбрионов в фолликуле требуется оптимальное значение антиоксидантной активности. Как уменьшение её (окислительный стресс), так и увеличение (антиоксидантный стресс) отрицательно сказываются на качестве эмбриона и исходе ЭКО. Эти данные соответствуют современной концепции о том, что для успешного развития ооцита требуется оптимальный уровень продукции АФК.

About the authors

Elena V. Proskurnina

M.V. Lomonosov State Moscow University

Email: proskurnina@gmail.com
MD, PhD, Associate Professor of the Department of Medical Biophysics of the Faculty of Fundamental Medicine of the M.V. Lomonosov State Moscow University, Moscow, 119991, Russian Federation Moscow, 119991, Russian Federation

M. A Shestakova

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, 117997, Russian Federation

A. K Rabadanova

M.V. Lomonosov State Moscow University

Moscow, 119991, Russian Federation

M. M Sozarukova

M.V. Lomonosov State Moscow University

Moscow, 119991, Russian Federation

R. I Shalina

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, 117997, Russian Federation

References

Supplementary files