IDENTIFICATION OF LUMINOUS BACTERIA ISOLATED FROM THE BLACK AND THE AZOV SEAS


Cite item

Abstract

The article studies phenotype of ten isolates of luminous bacteria isolated from water and fauna of the Black and Azov Seas. The following findings were obtained: four strains were identified as representatives of species Allivibrio fischeri, three strains were the representatives of species Photobacterium leiognathi and another three has been identified as Vibrio harveyi.

Full Text

Современным аналитическим подходам по обнаружению химических веществ свойственны такие недостатки, как: длительное время обнаружения, высокая стоимость оборудования и реагентов для анализа объектов, а также затрат на обучение и подготовку специализированного персонала [8]. Разработка и внедрение простого и недорогого скрининг-теста для быстрого анализа образца является одним из перспективных и востребованных направлений современных аналитических технологий. Так, методы с использованием биолюминесцентных тест-систем, соответствуют всем этим характеристикам и нашли широкое применение для обнаружения и изучения биологических свойств химических соединений [1]. Широкое использование светящихся организмов и тест-систем на их основе в последние десятилетия связано с тем, что биолюминесценция является общим показателем метаболизма клетки. Большое количество факторов, влияющих на рост, дыхание и биолюминесценцию клетки, может быть измерено посредством её регистрации [5]. Биолюминесценция представляет собой форму хемилюминесценции, генерируемой светящимися организмами, которые представлены большим количеством видов у 800 различных родов [1, 9]. Одни из самых известных представителей светящихся организмов - люминесцентные бактерии, большинство которых являются морскими представителями. Поскольку светящиеся бактерии приобрели разнообразные фенотипические признаки в ходе филогенеза, и как следствие, имеют различную чувствительность к химическим соединениям, поиск новых штаммов для анализа веществ различной природы представляет собой особый интерес. Цель исследования: изучение фенотипических особенностей люминесцентных бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей, для их первичной идентификации. Методика исследования Выделение люминесцентных бактерий из акваторий Черного и Азовского морей проводили в летне-осенний период путем забора образцов воды и объектов морской фауны, таких как черноморская мидия (Mytilus galloprovincialis), бычок-кругляк (Neogobius melanostomus), морской двустворчатый моллюск (Cerastoderma lamarcki), бычок-кнут (Mesogobius batrachocephalus), креветка обыкновенная (Crangon crangon) и бычок песочник Neogobius fluviatilis pallasi. Отобранные пробы воды фильтровали через мембранные бактериологические фильтры (мембраны типа МФАС-ОС, диаметр пор = 0,22 мкм, ЗАО НТЦ «Владипор», Россия), а полученный биоматериал механически измельчали до кусочков размером 0,5 см. Подготовленные образцы помещали на плотные питательные среды (HiMedia M002, Индия) с 3% содержанием натрия хлорида (НПФ «Невский химик», Россия) и культивировали при температуре (t) +250C в течение 16-24 часов в термостате (ТСО-1/80 СПУ, Россия) [5]. Выросшую биомассу оценивали на наличие светящихся зон в темной комнате. В случае обнаружения таких областей из них выделяли и очищали светящиеся микроорганизмы при помощи комплекса стандартных микробиологических методов [2]. Изучение морфофизиологических и биохимических свойств микроорганизмов для их последующей дифференцировки проводили по основным фенотипическим признакам семейства Vibrionaceae [4]. Морфо-культуральные характеристики светящихся изолятов изучали визуально и при помощи световой микроскопии. На плотных питательных средах зрительно оценивали величину, форму, цвет, консистенцию, контур края, структуру и характер поверхности колоний. Изучение морфологии бактерий под микроскопом проводили в нативных и окрашенных по Граму препаратах [2]. Физиологические свойства изолятов оценивали температурным оптимумом роста при их культивировании на жидких питательных средах (HiMedia M001, Индия), содержащих 3% натрия хлорида, при +40С, +200С, +250С, +350С и +370С в течение 24 часов. Биохимические свойства бактерий оценивали с использованием сред Гисса по их способности ферментировать такие субстраты, как глицерин, D (+)-маннит, сахарозу, D (+)-глюкозу, D (+)-мальтозу, D (+)-маннозу и D (+)-лактозу (AppliChem, Германия), концентрация которых составила 0,5% в пробе [2]. Каталазную активность изучаемых изолятов оценивали по реакции культивированной в течение ночи колонии клеток на питательном агаре при нанесении на ее поверхность 0,01 мл 3% раствора перекиси водорода (AppliChem, Германия) [7]. Оксидазную активность изучали с помощью коммерческого теста (OXItest Mikrolatest, Erba Lachema s.r.o., Чехия). Тест-полоску смачивали 0,002 мл дистиллированной воды, после чего на индикаторную зону тест-полоски наносили исследуемую культуру клеток и через 0,5-1 мин наблюдали за изменением окраски. Одним из подходов для изучения биохимических свойств изолятов в работе использовали метод, основанный на определении типа кинетики люциферазной реакции [3]. Для этого проводили накопления биомассы бактерий путем их культивирования в 500 мл жидкой питательной среды при постоянном перемешивании в течение 24 часов. Полученную систему центрифугировали при 3000об/мин в течение 15 мин в ОПН-8, удаляя супернатант. Оставшуюся в виде осадка массу клеток суспендировали в 5 мл натрий-фосфатном буфере с pH = 7,2±0,1 и подвергали осмотическому лизису путем поочередного замораживания и оттаивания бактериальной суспензии. После трехкратного повторения данной процедуры вновь центрифугировали систему. Осаждение белков проводили ступенчатым насыщением полученного супернатанта аммонием сульфатом от 20 до 80% (НПФ «Невский химик», Россия). Кинетику затухания люциферазной реакции изучали в присутствии додеканаля (Fluka, Швейцария). Анализируемая система состояла из 0,05 мл 0,01% водно-спиртовой эмульсии альдегида, 0,5 мл натрий-фосфатного буфера с pH=7,2±0,1 и 0,05 мл ферментного препарата с экспериментально подобранной концентрацией. Инициацию реакции проводили быстрым введением 0,5 мл раствора 10-5 моль/л фотовосстановленного ФМНН2 (AppliChem, Германия), содержащего 10- моль/л ЭДТА (AppliChem, Германия). По полученным данным определяли время полузатухания (t1/2), по значениям которого рассчитывали константу скорости люциферазной реакции (KLR=1/t1/2) как? характерный систематический признак для люминесцентных бактерий [6]. Результаты исследования и обсуждение В результате полевых и лабораторных исследований удалось выделить десять образцов культур клеток со стабильным свечением, которым были присвоены кодовые названия. Данные о районах и объектах выделения, присвоенные кодировки десяти люминесцентным изолятам и наличие у них желтого пигмента представлены в таблице 1. Колонии выделенных бактерий на плотных питательных средах у всех изучаемых объектов характеризовались слизистой консистенцией, аморфной структурой, гладкой и выпуклой поверхностью с ровным краем в форме круга. При оценке размеров образующихся колоний после 24-часового культивирования микроорганизмов на питательном агаре все изоляты разделили на три группы: крупные колонии диаметром (d) от 5 мм и более образовывали бактерии с кодами C1, Wsh и Ms3; среднего размера (d = 3-5 мм) колонии характеризовались Sh1, M1, Fsh, F1, W2`, и мелкие и/или точечные колонии, для которых d≤3 мм, обладали изоляты Wy, Fy. При микроскопии нативных препаратов исследуемых бактерий установили, что все они подвижны и имеют палочковидную форму. При окраске изолятов по методу Грама их тинкториальные свойства соответствовали грамотрицательным бактериям. При культивировании выделенных изолятов в жидких питательных средах при t=+40С не удалось зарегистрировать свечения и увеличения биомассы клеток. В то же время в остальном диапазоне изучаемых температур микроорганизмы характеризовались наличием люминесценции и приростом общего числа клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что среди выделенных образцов нет представителей видов Vibrio logei и Photobacterium phosphoreum [1]. При изучении биохимических свойств выделенных чистых культур светящихся бактерий выявили их индивидуальные особенности по способности к ферментации заданных субстратов, а также по наличию каталазной и оксидазной активности, которые представлены в таблице 2. Сравнительный анализ результатов проведенных исследований позволил первично идентифицировать пять изолятов. Бактерий F1, Wsh и Fy в экспериментах по изучению ферментативных свойств окисляли маннит, глюкозу, D (+)-мальтозу и D (+)-маннозу, они обладали желтым пигментом и каталазной активностью, а также характеризовались люминесценцией и увеличением биомассы при температурах от +200С до +370С. Они не образовывали кислот и/или газа при наличии в пробах глицерина, сахарозы и D (+)-лактозы. Наличие всех этих признаков указывает на характерные фенотипические свойства такого вида, как A. fischeri. Изоляты с кодировкой Ms3 и W2` отнесли к виду V. Harveyi, поскольку они ферментировали все субстраты кроме лактозы, а также обладают каталазной и оксидазной активностью. У этих культур клеток не наблюдали желтого пигмента, а увеличение биомассы и люминесценции регистрировали в диапазоне t=+200С - +370С. Для первичной идентификации остальных изолятов провели проверку кинетических характеристик люцифераз, результаты которой представлены в виде графических зависимостей интенсивности свечения от времени на рисунке 1. По времени полузатухания люциферазной реакции рассчитали KLR, по значениям которой определили тип кинетики - характерный систематический признак для люминесцентных бактерий. Изоляты с кодом C1, Sh1, Wy, Fsh характеризовались быстрым типом кинетики, при KLR=0,75 с-, 0,83 с-, 0,51 с-, 0,52 с- соответственно, а изолят M1 - медленной кинетикой с показателем KLR=0,091с- [9]. Таким образом, изоляты с кодировкой Sh1, Wy, Fsh отнесли к виду P. Leiognathi, поскольку они ферментировали только глюкозу и маннозу, не обладали желтым пигментом и каталазной активностью, а также характеризовались KLR больше чем 0,5 с-. Изолят M1 окислял маннит, глюкозу, D (+)-мальтозу, D (+)-маннозу, обладал каталазной и оксидазной активностью, но не ферметировал сахарозу - один из основных субстратов вида V. harveyi [6]. При изучении кинетических свойств люцифераз KLR M1 составила 0,91с-. Совокупность данных показателей позволила предположить принадлежность изолята М1 к виду V. harveyi. Изолят С1 отнесли к виду A. Fischeri, поскольку при изучении ферментативных свойств он окислял только глюкозу, характеризовался KLR = 0,75 с- и положительным ответом в оксидазном тесте, а также содержал желтый пигмент. Заключение В результате отбора проб воды, рыбы, креветок и моллюсков из прибрежных зон Черного и Азовского морей, выделения из них светящихся микроорганизмов удалось получить десять стабильных, чистых образцов люминесцентных бактерий. При изучении морфологических особенностей, выделенных изолятов на плотных и жидких питательных средах выявлены отличия только в размере колоний и наличие желтого пигмента. Бактерии с кодом C1, Wsh и Ms3 образовывали колонии d ≥ 5 мм. Штаммы Sh1, M1, Fsh, F1, W2` характеризовались колониями, для которых d=3-5 мм, а d ≤ 3 мм обладали Wy, Fy. Скопления клеток изолятов C1, Fy, F1, и Wy имели желтый пигмент. Все выделенные изоляты характеризовались оптимумами роста при t от +20 до +370С, что явилось основанием для исключения их принадлежности к психрофильным видам V. logei и P. phosphoreum. Биохимические свойства исследуемых объектов имели следующие особенности: бактерии Ms3, W2`, Fsh, Wsh ферментировали глицерин. M1, F1, Wsh, Fy, Ms3, W2` расщепляли маннит и мальтозу, Ms3, W2` - сахарозу. Только C1 не ферментировал маннозу. Все изоляты окисляли глюкозу. Ms3, W2`, M1, Wsh обладали каталазной активностью, а Sh1, M1, Fsh, C1, F1, Wsh, Fy, Ms3 содержали оксиредуктазы. По результатам изучения скорости затухания люциферазной реакции в присутствии додеканаля быстрым типом кинетики характеризовались изоляты С1, Sh1, Wy, Fsh при KLR, равной 0,75 с-, 0,83 с-, 0,51 с-, 0,52 с- соответственно, а медленным типом - М1 с KLR = 0,091с-. По результатам проведенных исследований удалось первично идентифицировать все выделенные изоляты. Согласно таксономике люминесцентных микроорганизмов, к виду A. fischeri отнесли F1, Wsh, Fy и С1, к V. harveyi - Ms3, W2 и М1, а к P. leiognathi - Fsh, Sh1 и Wy. Конфликт интересов отсутствует.
×

About the authors

S L SAFRONYUK

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: pharmalab01@mail.ru

E T SHARIPOV

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: edemsharipov@gmail.com

A M KATSEV

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: ketsev@mail.ru

References

  1. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. - Новосибирск: Наука, 2009. - 245 c.
  2. Зверев В.В. Микробиология, вирусология. Руководство к практическим занятиям / Под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. - М: Геотар-Медиа, 2017. - 360 с.
  3. Кацев А.М. Ферментативная активность светящихся бактерий Черного и Азовского морей и их антиоксидантная защита // Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Сер. Биология. Химия. - 2014. - Том 27. - № 3 (66). - С. 184-193.
  4. Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology. Volume Two: The Proteobacteria, Part B, The Gammaproteobacteria. Editor-in-chief George Garrity Springer US. - 2005. - 1203 p.
  5. Bolelli L., Ferri E.N., Girotti S. The management and exploitation of naturally light-emitting bacteria as a flexible analytical tool: A tutorial. // Analytica Chimica Acta. - 2016. - Vol. 934. - P. 22-35.
  6. Deeva A.A., Temlyakova E.A., Sorokin A.A., Nemtseva E.V., Kratasyuk V.A. Structural distinctions of fast and slow bacterial luciferases revealed by phylogenetic analysis // Bioinformatics. - 2016. - Vol. 32 (20). - P. 3053-3057.
  7. Dong W., Hou Y., Li S., Wang F., Zhou J., Li Z., Wang Y., Huang F., Fu L., Huang Y., Cui Z. Purification, cloning, expression, and biochemical characterization of a monofunctional catalase, KatP, from Pigmentiphaga sp. DL-8. // Protein Expression and Purification. - 2015. - Vol. 108. - P. 54-61.
  8. Je H.J., Kim M.G., Kwon H.J. Bioluminescence Assays for Monitoring Chondrogenic Differentiation and Cartilage Regeneration // Sensors (Basel). - 2017. - Vol. 17(6). - Р. 1306.
  9. Steven H.D. Haddock, Mark A. Moline, James F. Case. Bioluminescence in the Sea // Annual Review of Marine Science - 2010. -Vol. 2 - P. 443-493.

Copyright (c) 2017 SAFRONYUK S.L., SHARIPOV E.T., KATSEV A.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies