THE STATUS OF THE GENE K-RAS IS AN INDEPENDENT PROGNOSTIC CRITERION IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

Full Text

Колоректальный рак (КРР) является одной из главных проблем современной онкологии из-за высокой заболеваемости и значительной смертности в России и других развитых странах Америки, Европы и Азии. Ежегодно в мире регистрируют более 1 млн. 200 тыс. больных раком ободочной и прямой кишки и 700 тыс. смертей от него. Поздняя диагностика остается одной из основных причин высокой смертности при КРР. По данным международной статистики, больные раком толстой кишки во время первичной диагностики распределяются по стадиям следующим образом: I - 15%, II - 20-30%, III - 30-40%, IV - 20-25%. Таким образом, более чем у половины больных диагноз устанавливается при III-IV стадии заболевания. Непрекращающиеся исследования в области фундаментальной онкологии, появление новых подходов к диагностике и лечению больных колоректальным раком, а также опыт наблюдения за такими больными обусловливают выделение новых факторов прогноза в рамках даже одной и той же стадии заболевания. Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является мутация в гене K-RAS . Частота мутации гена K-RAS в опухолях толстой кишки, по данным различных авторов, встречается от в 30-50% случаев [1, 4]. Проводятся исследования влияния пола, возраста пациента, клинико-морфологических данных опухоли на частоту мутации гена K-RAS [1, 2, 6]. Установлено, что опухоли с наличием мутации в гене K-RAS не отвечают на терапию ингибиторами рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [8]. Сведения о прогностической значимости мутации гена в опухоли противоречивы и остаются предметом для дискуссий [1, 5, 7]. Цель исследования: изучить частоту мутации в гене K-RAS у больных колоректальным раком в Республике Татарстан. Исследовать взаимосвязь мутации в гене K-RAS с клинико-морфологическими показателями опухоли для выявления факторов, влияющих на течение и прогноз заболевания. Материалы и методы В исследование включены 120 пациентов с колоректальным раком, получивших комбинированное лечение в ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ». В исследование включены больные от 34 до 84 лет, средний возраст составил 62,4±10,21 лет. Из них 32 больных раком ободочной кишки, 62 больных раком прямой кишки, 26 больных раком сигмовидной кишки и ректосигмоидного отдела. Распределение больных по стадиям классификации TNM показало, что опухоли стадии Т2 были у 19,6%, Т3 - у 23,6%, Т4 - у 56,8% больных. Регионарные метастазы отсутствовали у 45,3% больных , N1 диагностирован в 44,6%, N2 - в 10,1% случаев. Пациентам был проведен генетический анализ на наличие мутации в гене K-RAS на материале, полученном в результате оперативного вмешательства. Материалом исследования служили образцы опухолевой ткани из первичной опухоли и/или отдаленных метастазов, залитые в парафиновые блоки. Выделение опухолевых клеток производили методом стереотактической диссекции под контролем световой микроскопии со срезов, содержавших более 40% опухолевых клеток. После проведения ПЦР для достижения необходимого числа копий ДНК осуществляли определение мутаций по отклонению кривых плавления. Статистическую обработку данных проводили с применением пакета статистических программ на IBM-совместимом персональном компьютере с использованием приложений Microsoft Excel пакета Office XP Service Pack 2 и Statistica (StatSoft) версии 6.0. Для проведения сравнительного анализа полученных данных был применен критерий Стьюдента, а при несоблюдении условий его применимости - критерий Манна-Уитни. Сравнение долей осуществляли при помощи критерия χ, двустороннего варианта точного критерия Фишера. Исследование показателей выживаемости проводили методом Каплана-Майера. Выделение ДНК из опухолевого материала проводили с помощью наборов «ДНК-ткань-Ф» (ТестГен, Димитровград) согласно инструкции компании-производителя (для парафиновых блоков использовались 4 среза толщиной 10 мкм). Стандартные плазмидные образцы, содержащие мутации, использовали в качестве положительного контроля. Искусственно синтезированные фрагменты ДНК размером 300 п.н., содержащие мутацию, вставляли в вектор pAL-TA. Плазмиды со вставкой были произведены ЗАО «Евроген» (г. Москва). Концентрацию определяли с помощью метода стандартных разведений, используя в качестве референса геномную ДНК Jurkat Genomic DNA (Thermo Fisher, США). Содержание мутантной ДНК варьировалось от 0% до 10%. Для детекции мутаций в гене K-RAS использовались смеси праймеров и зондов в конечных концентрациях 900 и 600 нМ соответственно. Для ПЦР «в реальном времени» использовали термоциклер «Rotor-Gene 6000» (Qiagen, Германия), ПЦР-смесь готовили в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов, 1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Условия амплификации фрагментов ДНК: 95C/2 мин - 1-й цикл; 94C/10 сек, 62C/60 - 60 циклов. Комплекты олигонуклеотидов были разработаны и произведены ООО «Тестген» (г. Димитровград). Список определяемых мутаций в генах K-RAS представлен в таблице 1. Tаблица 1 Мутации, определяемые в гене K-RAS В кодоне 12 В кодоне 13 Gly12Ser (GGT>AGT) Gly13Asp (GGC>GAC) Gly12Arg (GGT>CGT) Gly12Cys (GGT>TGT) Gly12Asp (GGT>GAT) Gly12Ala (GGT>GCT) Gly12Val (GGT>GTT) Результаты собственных исследований Из 120 пациентов у 35 выявлена мутация в гене K-RAS , у 85 пациентов имелся «дикий» тип гена (частота мутаций составила 26,7%). Это несколько меньше, чем в целом по России, что, вероятно, связано с выраженной этнической гетерогенностью населения в данном регионе. Все мутации были обнаружены в первичной опухоли. Мутации гена K-RAS в 12 кодоне наблюдали в 68% случаев, в 13 кодоне - в 32% соответственно. Преимущественно в g12v (20%), g13d (33%), g12d (20%), g12s (7%), g12c (20%) кодонах. У женщин частота мутаций в гене K-RAS встречалась чаще (37,7%),чем у мужчин (20,3%). Данные зависимости значимы (р=0,045). В отличие от других исследований, мы отметили снижение частоты мутации в гене K-RAS в более старших возрастных группах - менее 10% в возрасте старше 60 лет и 56,3% в возрасте до 50 лет. Данная зависимость статистически значима (р=0,001). Республика Татарстан имеет свои популяционные особенности. На ее территории проживают 2 титульные нации примерно в равной численности. На протяжении многих столетий совершались межнациональные браки. Тем не менее, результаты наших исследований показали, что у пациентов русской национальности мутации гена K-RAS встречались несколько чаще - в 39% случаев, чем у татар (21%). У пациентов, имеющих регионарные метастазы, мутации гена K-RAS встречались значительно чаще (45,8%) , чем при их отсутствии (4,9%). Данная зависимость является статистически значимой (р=0,001). Проведенное исследование показывает, что опухоли толстой кишки с мутантным типом гена K-RAS более склонны к лимфогенному метастазированию, чем опухоли с «диким» типом, что косвенно свидетельствует о более агрессивном течении опухолевого процесса при мутации гена. При наличии отдаленных метастазов мутация гена K-RAS была выявлена в 1/3 наблюдений. При сопоставлении частоты мутации гена K-RAS в зависимости от локализации опухоли нами были выявлены следующие закономерности. У больных раком прямой кишки частота мутации составила 54,3%, раком сигмовидной кишки и ректосигмоидного отдела - 25,7%, раком ободочной кишки - 20%. Таким образом, чем дистальнее располагается опухоль, тем чаще в опухоли встречается мутантный тип гена K-RAS. Анализ прогностической значимости мутации гена K-RAS показал, что среди 85 пациентов с «диким» типом гена K-RAS в опухоли в течение года умерли 3 человека, годичная выживаемость составила 96,5%. Из 35 пациентов с «мутантным» типом гена K-RAS в опухоли умерли 4 больных. Годичная выживаемость пациентов с мутантным типом составила 88,6%. Учитывая незначительное количество летальных исходов и небольшой срок наблюдения, данное различие в выживаемости пациентов статистически не достоверно (р>0,05). Заключение Таким образом, наличие мутации в гене K-RAS при колоректальном раке чаще встречается у пациентов молодого возраста, женского пола, у представителей русской национальности. Опухоли, имеющие мутации в гене K-RAS , чаще метастазируют в регионарные лимфатические узлы и дают отдаленные метастазы. Пациенты с мутацией в гене K-RAS имеют более низкую годичную выживаемость. Как показали результаты нашего исследования, мутация в гене K-RAS является неблагоприятным признаком в отношении прогноза и течения КРР и может служить независимым значимым прогностическим признаком. Исходя из этого, необходим персонифицированный подход к лечению больных КРР с наличием мутации в гене K-RAS . Генетические исследования можно рекомендовать для включения в стандарт обследования больных колоректальным раком в качестве предиктивных маркеров для оценки течения заболевания и прогнозирования отдаленных результатов лечения больных. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

B I GATAULLIN

Kazan State Medical Academy; Republican Clinical Oncological Dispensary

Email: bulatg@list.ru

M G GORDIYEV

Kazan State Medical Academy; Republican Clinical Oncological Dispensary

Email: marat7925@gmail.com

R K SHAKIROV

Kazan State Medical Academy; Republican Clinical Oncological Dispensary

Email: shrafa@rambler.ru

I G GATAULLIN

Kazan State Medical Academy; Republican Clinical Oncological Dispensary

Email: ilgizg@list.ru

References

Supplementary files