HPLC OF THE COMPLEX OF TERPENOIDS OF EUCALYPTUS VIMINALIS LABILL

Full Text

Введение Эвкалипт прутовидный (Eucalyptus viminalis Labill.) - представитель семейства Миртовые (Myrtaceae) - веченозеленое дерево, широко культивируемое на территории России (Черноморское побережье Краснодарского края) и близлежащих стран (Абхазия, Грузия, Азербайджан). Листья эвкалипта обладают бактерицидным, противовоспалительным, вяжущим, отхаркивающим, бронхолитическим и анальгетическим действием [7]. Сырье содержит эфирное масло - ведущую группу биологически активных соединений (БАС) до 3 %, главной составной частью которого является 1,8-цинеол (эвка-липтол), содержание которого достигает 60 %. В числе других компонентов эфирного масла - моноциклические монотерпены: пиперитон, а-фелландрен; бициклические - D-миртенол, а-пинен, камфен и др.; трициклические сесквитерпены - глобулол; в сырье содержатся также алифатические альдегиды. Второй группой БАС являются эуглобали, или фенолоальдегиды терпенои-дов (в частности, эувималь-1), относящиеся к группе флороглюцинов и обладающие высокой антимикробной активностью, сопоставимой с таковой некоторых антибиотиков (но без развития привыкания) [2, 8, 9]. Несмотря на то, что в РФ существует нормативная документация на листья эвкалипта (ГФ СССР XI издания, ст. 15), в настоящее время актуальным представляется вопрос совершенствования методик анализа с учетом современного уровня развития фармацевтического анализа и с ориентиром на необходимость обнаружения терпеноидной гаммы, и, в частности, специфической и наиболее высоко активной группы БАС - эуглобалей [4, 5]. В связи с этим целесообразным является решение проблемы стандартизации в ряду: листья эвкалипта прутовидного - спирто-водное извлечение (настойки и экстракты) - комплексные препараты. Последнее обстоятельство указывает на необходимость привлечения метода ВЭЖХ-анализа, поскольку в случае многокомпонентных препаратов традиционно используемые для анализа эфирного масла методы ГХ и ГЖХ анализа не смогут быть применены без трудоемкой пробоподготовки для большинства классов природных БАС [1, 6, 10]. Целью настоящего исследования являлась разработка методик анализа терпеноидного комплекса листьев эвкалипта прутовидного с использованием метода ВЭЖХ. В задачи исследования входило: - хроматографическое исследование терпе-ноидной гаммы листьев эвкалипта прутовидного; - разработка методики качественного анализа; - разработка методики количественного анализа эуглобалей; - адаптация разработанных методик для лекарственных препаратов эвкалипта. Результаты и их обсуждение Для предварительного изучения химического состава БАС в спирто-водном извлечении из листьев эвкалипта на 70 % спирте этиловом (оптимальный экстрагент для извлечения аналитов) использовался ТСХ-анализ, традиционно применяемый для целей первичной идентификации действующих веществ. Использовались пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» (ТУ 26-11-17-89, зернение 5-17 мкм, тип сорбента - силикагель СТХ-1А, Россия), хроматографирование осуществлялось восходящим способом. Подготовку хроматографических пластинок осуществляли по стандартной методике в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0003.15 ГФ РФ XIII издания [3]. В исследованиях были применены следующие системы растворителей: А - хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3); Б - хлороформ - этанол (2 : 1), (4 : 1), (6 : 1), (9 : 1); В - н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2). В результате проведенных исследований было установлено, что наилучшее разделение достигается в системе хлороформ - этанол (4 : 1). Детекция веществ осуществлялась в видимом и УФ-свете при 254 нм и 366 нм до и после обработки хроматограмм 10 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты. Терпеноидные соединения обнаруживались в виде сине-фиолетовых пятен на желтоватокоричневом фоне. Анализ хроматограмм показал наличие характерных пятен фиолетового цвета на хроматограммах спирто-водного извлечения на уровне пятна РСО эвкалими-на (ВИЛАР), представляющего собой сумму эуглобалей. Полученные данные подтверждают факт перехода нативных терпеноидных соединений (а также комплекса соединений фенольной природы), содержащихся в листьях эвкалипта, в извлечение, что позволяет использовать подобранные условия проведения анализа в решении проблемы стандартизации фитопрепаратов на основе эвкалипта. Аналогично (в предложенных условиях ТСХ) был исследован ряд настоек эвкалипта, полученных промышленным способом (производства Тульской, Ивановской, Тверской фармацевтических фабрик), в качестве РСО использовался эвкалимин. Результат показал наличие нативного терпеноидного комплекса в изученных образцах. В ходе дальнейших исследований нами изучена возможность использования метода ВЭЖХ-анализа для целей качественного A 360 330 254 270 Рис. 2. ВЭЖХ -анализ РСО эвкалимина Fig. 2. HPLC analysis of Working standard of eucalimin и количественного анализа лекарственных препаратов эвкалипта прутовидного (на 70 % спирте этиловом). Поскольку ВЭЖХ-анализ является одним из самых информативных методов в плане идентификации веществ (по времени удерживания по сравнению с веществами-стандартами) и их количественного определения, то параллельно оценивался хроматографический профиль всей нативной гаммы БАС. Для объективизации исследований был использован РСО эвкалимина. Определение проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-5» (НПО «Научприбор», Россия) в изократиче-ском режиме (стальная колонка - Диасорб С-16 № 2075 (2 мм х 80 мм)). Температура в хроматографической комнате в процессе эксперимента составила 22-23 °С. Подвижной фазой являлись различные соотношения ацетонитрила и воды (3 : 7; 2 : 8; 2,5 : 7,5) с добавлением 1 % уксусной кислоты, скорость 1Л1 элюирования: 100 мкл/мин; объем элюента: 2500 мкл; объем пробы: 5 мкл. В результате исследований посредством сравнения спектральных отношений извлечения (и в последующем - настоек) эвкалипта и РСО эвкалимина мы пришли к заключению, что оптимальной системой, позволяющей достичь наиболее эффективного хроматографического разделения аналитов, явилась система ацетонитрил - вода (2,5 : 7,5) с добавлением 1 % уксусной кислоты. Все хроматограммы обрабатывали по схеме: сглаживание 20 единиц ^ разметка пиков (проводили вручную) при 1 = 254; 270; 290; 330 нм. На рисунках 1 и 2 представлены хроматограммы настойки эвкалипта прутовидного и эвкалимина. Из представленных данных видно, что время удерживания пика 1 настойки эвкалипта совпадает со временем удерживания эвкалимина, что служит подтверждением его наличия в настойке. Данный факт T 360 330 290 270 254 0.050 2.000 4.000 Рис. 1. ВЭЖХ -анализ настойки эвкалипта 6.000 8.000 10.000 Fig. 1. HPLC analysis of eucalyptus tincture т может служить надежным доказательством подлинности и качества лекарственного препарата эвкалипта и позволяет защитить конечного потребителя от фальсифицированной продукции. Методика ВЭЖХ-анализа фенолальдегидов терпеноидов ВЭЖХ-анализ эуглобалей проводится после предварительной пробоподготовки с применением гексана. Гексановые извлечения из лекарственного препарата получают при семикратной обработке по 5 мл гексана 5 мл исходного препарата с использованием делительной воронки. Полученные гексановые извлечения объединяют в мерную колбу емкостью 50 мл, доводят гексаном до метки. Определение проводят на ВЭЖХ хроматографе «Милихром-5», в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка - Диасорб С-16 № 2075 (2 мм х 80 мм); подвижная фаза - система ацетонитрил - вода (2,5 : 7,5) с добавлением 1 % уксусной кислоты; объем элюента - 2500 мкл, объем пробы - 5 мкл, скорость элюирования - 100 мкл/мин. Детекцию веществ осуществляли при пяти длинах волн - 254, 270, 290, 330 и 360 нм. Содержание суммы фенолоальдегидов тер-пеноидов в исследуемых образцах листьев эвкалипта составило 3,56 ± 0,5 %. Проведенный блок исследований может служить основой для решения вопросов химической стандартизации комплексных препаратов с включением в состав листьев эвкалипта. Такие исследования были, в частности, проведены нами в отношении разработанного фитопрепарата «Дентос» на основе пяти видов лекарственного растительного сырья, содержащего разнообразные по физико-химическим характеристикам группы БАС. заключение Таким образом, в результате хроматографического изучения терпеноидной гаммы эвкалипта методами ТСХ и ВЭЖХ были разработаны методики качественного и количественного анализа сырья и некоторых препаратов растения. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

A S Lаpinа

Samara State Medical University

Email: nstjlapina@rambler.ru
Post-graduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and Basics of Phytotherapy.

N R Varina

Samara State Medical University

Email: shagalieva.nr@mail.ru
Candidate of Pharmaceutical Sciences, Assistant, Department of Pharmacognosy with Botany and Basics of Phytotherapy.

V A Kurkin

Samara State Medical University

Email: kurkinvladimir@yandex.ru
Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and Basics of Phytotherapy.

E V Avdeeva

Samara State Medical University

Email: avdeeva.ev@gmail.com
Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Department of Pharmacognosy with Botany and Basics of Phytotherapy.

I A Platonov

Samara National Research University

Email: pia@ssau.ru
Doctor of Engineering, Professor, Head of the Chemistry Department.

N V Nikitchenko

Samara State Technical University

Email: navinita@mail.ru
Candidate of Chemical Sciences, Leading researcher of the Department of Chemistry and Technology of Organic Nitrogen Compounds.

References

Supplementary files