MALT-LIMPHOMA OF THE STOMACH AND LYMPHOID HYPERPLASIA IN THE BACKGROUND OF HELICOBACTER-ASSOCIATED GASTRITIS: MORPHOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL FEATURES

Full Text

Заболевания, ассоциированные с H. pylori, являются одними из наиболее распространенных болезней человечества. К H. pylori-ассоциированным болезням относятся хронический гастрит (ХГ), язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, полипы, рак желудка и MALT-лимфома желудка. В Маастрихтском консенсусе IV доказывается связь инфицирования H. pylori c B12-дефицитной, железодефицитной анемией, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, функциональной диспепсией, НПВП-гастропатией. Прогрессирование хронического неатрофического хеликобактер-ассоциированного гастрита (ХНГ) в атрофический гастрит с постепенным развитием метаплазии и дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка (СОЖ) служит обязательным условием рака желудка. В свою очередь, последовательность событий, началом которых является инфицирование H. pylori, а конечным - рак желудка, получил название каскада Коррея. Необходимо отметить, что схожая с каскадом Коррея цепь явлений наблюдается и при возникновении MALT-лимфомы желудка. Для ХГ, ассоциированного с H. pylori, характерным является возникновение и прогрессирование лимфоидной гиперплазии (ЛГ), не встречающейся в здоровой СОЖ. Определено наличие тесной взаимосвязи между нарушением клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ с нарушением клеточного баланса лимфоидной ткани у пациентов с H. pylori-ассоциированным гастритом [9]. Показано, что у лиц с H. pylori-ассоциированной мальтомой желудка риск развития рака желудка кишечного типа возрастает в несколько раз [6]. Верифицировано, что при прогрессировании гастрита и MALT-лимфоме желудка нарушается экспрессия различных регуляторных молекул р53, Bcl-2 Ki-67, NF-kb [3, 4, 5, 7, 8]. В свою очередь, раскрытие новых механизмов прогрессирования хронического гастрита, ассоциированного с H. Pylori, позволит улучшить прогнозирование его течения и избежать возможной трансформации в MALT-лимфому. Цель исследования: определение новых механизмов возникновения MALT-лимфом желудка на основе анализа эндоскопических и морфофункциональных данных. Материал и методы исследования Исследуемую группу составили 49 пациентов с MALT-лимфомами желудка. Больные находились на обследовании и лечении в Самарском областном клиническом онкологическом диспансере с 2010 по 2014 годы: 23 мужчины и 26 женщин. Медиана возраста составила 66 лет. Среди пациентов с MALT-лимфомой, вошедших в исследование, 19 (38,8%) было с I стадией и 30 (61,2%) - со II стадией заболевания. Все больные с MALT-лимфомой желудка были разделены на 2 подгруппы в зависимости от стадии заболевания: I или II стадия. Всего в исследования включены 3 однородные по полу, возрасту и численности группы сравнения: 30 чел. с ХНГ и наличием лимфоидной гиперплазией (ЛГ) 1 и 2 степеней; 30 чел. с хроническим атрофическим гастритом (ХАГ) в сочетании с ЛГ 1 и 2 степени, 30 чел. с ХАГ с ЛГ 3 и 4 степеней по шкале Wotherspoon A.C. (1993). Эрадикация H. pylori проводилась стандартной схемой 1 линии и включала омепразол в дозе 20 мг 2 раза в сутки, кларитромицин в дозе 500 мг 2 раза в сутки и амоксициллин в дозе 1000 мг 2 раза в сутки в течение 10 дней. У пациентов с недостаточной эффективностью антихеликобактерной терапии применена схема эрадикационной квадротерапии, включающая препараты висмута. При неэффективности второй линии эрадикационной терапии после предварительного определения чувствительности H. pylori к антибиотикам применялась третья линия антихеликобактерной терапии. Принимая во внимание недостаточную эффективность эрадикационной терапии, наличие выраженных клинических симптомов и глубокое поражение стенки желудка у пациентов со II стадией MALT-лимфомы, наряду с эрадикационной терапией назначалась химиотерапия, включающая схемы R-СHOP или R-CVP. Критерии включения: пациенты с I и II стадией (Lugano, 1994) MALT-лимфомы желудка с отсутствием транслокации - t (11;18). MALT-лимфомы низкого класса, в соответствии с классификацией D. de Jong и соавт. (1997). Инфицированность H. pylori. Больные с ХНГ и ХАГ с ЛГ. Успешно выполненная эрадикационная терапия H. pylori. Возраст пациентов от 60 до 74 лет. Критерии исключения: пациенты с IV стадией MALT-лимфомы желудка, пациенты с MALT-лимфомами с транслокацией - t (11;18). Отсутствие инфицированности H. pylori. Возраст моложе 60 и старше 74 лет. В исследовании применен стандартный набор клинических и инструментальных методов исследования. Для топографической диагностики патологических изменений слизистой оболочки желудка применяли хромоэндоскопию с метиленовым синим. Для диагностики H. pylori-инфекции применялся гистологический метод с использованием окраски по Романовскому-Гимзе и быстрый уреазный тест. Общее гистоморфологическое исследование биоптатов и иммуногистохимическое исследование проводилось на базе Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им Д.О. Отта, при научном консультировании д.м.н. профессора И.М. Кветного. Полученный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН=7,2) в течение 24 часов. Последующую обработку проводили в изопропиловом спирте по стандартной методике с изготовлением парафиновых блоков. С каждого блока были выполнены срезы толщиной 4 мкм и окрашены гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического окрашивания серийные парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Исследования проводились на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Температурная демаскировка антигенов проводилась с использованием 0,01М цитратного буфера рН 6,0 под давлением. С целью блокады эндогенной пероксидазы стекла помещали в 3%-й раствор перекиси водорода на 10 минут. Для промывки использовался трис-NaCl-буфер рН 7,6. Для выявления экспрессии Bcl-2 использовали Monoclonal Mouse Anti-Human Bcl-2 Oncoprotein (Clone 124, DAKO), разведение 1:50, время инкубации 30 минут при комнатной температуре; для выявления экспрессии p53 использовали Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein (Clone DO-7, DAKO), разведение 1: 25, время инкубации 30 минут при комнатной температуре; для выявления экспрессии Ki-67 использовали Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen (Clone MIB-1, DAKO), разведение 1:75, время инкубации 30 минут при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с полимером, маркированным пероксидазой (универсальный набор DAKO EnVisionTM). Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса DAB+ и субстратного буфера (DAKO). Изучение препаратов проводилось в исследовательском микроскопе Nikon Eclipse400 с использованием встроенной фотокамеры Nikon DXM1200. Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Морфология 5.2 (Видеотест). В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении х 400. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых молекул. Диагностика MALT-лимфом желудка по стадиям основывалась на классификации Lugano (1994). Эндоскопическое описание MALT-лимфом желудка базировалось на классификации Б.К. Поддубного и соавт. (1981) [1]. Эффект от проводимой эрадикационной и химиотерапии оценивался по рекомендациям, предложенным И.В. Поддубной [2]. Соответственно, полная ремиссия определялась при отсутствии клинической симптоматики и исчезновении всех эндоскопических и эндосонографических признаков опухолевого процесса в желудке, отрицательных результатах морфологического и иммуногистохимического исследования гастробиоптатов. Частичная ремиссия верифицировалась при уменьшении всех измеряемых опухолевых проявлений на 50% и более. Стабилизация опухолевого процесса диагностировалась при отсутствии выраженных изменений (уменьшение опухолевых проявлений менее чем на 50%, увеличение - менее чем на 25%). Прогрессирование констатировалось при отсутствии эффекта от проводимой терапии, увеличении размеров опухоли на 25% и более, появлении новых опухолевых очагов в желудке. Обработка полученных данных производилась в программах «Microsoft Excel 5,0 for Windows» и «SPSS 21.0 for Windows» операционной системы Windows 2010. При обработке материала определялись средние значения, стандартное отклонение, ошибка. Нормальность распределения исследуемых показателей определялась по критериям Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. При сравнении средних показателей между исследуемыми группами применяли t - критерий Стьюдента. При отсутствии нормальности распределения группы сравнивались по непараметрическим критериям Манна-Уитни-Вилкоксона и Краскела-Уоллиса. Между параметрами оценивались корреляционные связи по Пирсону и Спирмену. Номинальные признаки (жалобы, данные анамнеза, сопутствующие заболевания) сравнивались с помощью критерия χ2 Пирсона. Результаты считались статистически значимыми при р0,05. Результаты исследования и их обсуждение На боль в эпигастральной области предъявляли жалобы 27 (90%) лиц с MALT-лимфомой II стадии; среди пациентов с I стадией MALT-лимфомы таковых было 11 (57,9%) человек, 15 (50%) пациентов с MALT-лимфомой II стадии характеризовали боль как умеренную или интенсивную, тогда как среди больных с I стадией заболевания таковых было 4 (21,1%) человека. Общая интенсивность болевого синдрома по ВАШ у лиц со II стадией (5,07±0,47 баллов) заболевания достоверно превосходило (р0,05) таковую у пациентов с I стадией болезни (3,73±0,45 баллов). Также у больных со II стадией MALT-лимфомы достоверно чаще (р<0,05) по сравнению с I стадией заболевания встречались внежелудочные симптомы: снижение аппетита - у 14 (46,7%) против 6 (31,6%); похудание - у 8 (26,7%), при I стадии заболевания похудание не обнаруживалось; общая слабость - у 10 (33,3%) против 1 (5,3%); анемия - у 6 (20%), при I стадии не обнаруживалась. У больных со II стадией заболевания достоверно чаще (р0,05) встречалась язвенная форма заболевания: у 19 (63,3%) против 5 (26,3%), и достоверно реже (р<0,05) - гастритоподобная форма: при I стадии - у 9 (47,4%), при II стадии - не встречалась. По остальным формам достоверных различий не было (р>0,05): соответственно, инфильтративная форма определялась у 3 (10%) больных со II стадией болезни и у 5 (26,3%) - при I стадии; инфильтративно-язвенная форма - у 5 (16,7%) лиц со II стадией опухоли, при I стадии не обнаруживалась. Экзофитная форма зарегистрирована у 1 больного со II стадией; смешанная - у 2 больных. При I стадии заболевания данные формы опухоли не обнаруживались. У пациентов с MALT-лимфомой желудка I стадии опухоль, как правило, ограничивалась антральным отделом желудка (10 чел. - 52,6%); реже поражалось тело (4 чел. - 21,1%), у 3 чел. наблюдался мультицентрический рост опухоли, у 2 чел. опухоль располагалась в фундальном отделе желудка. У больных со II стадией заболевания достоверно чаще (р<0,05), по сравнению с I стадией заболевания, верифицировался мультицентрический рост опухоли (у 11 чел. - 36,7%). Другие локализации по частоте встречаемости достоверно не различались по сравнению с I стадией заболевания: у 9 (30%) чел. определялось поражение антрального отдела желудка, у 7 (23,3%) чел. тело желудка, у 2 чел. определялось тотальное поражение желудка и у 1 чел. - локализация опухоли в фундальном отделе. Гистологическое исследование СОЖ вне опухолевого очага у всех пациентов диагностировало ХАГ, ассоциированный с H. pylori. Необходимо отметить, что у 34 (69,4%) больных верифицировался ХГ III-IV стадии по классификации OLGA. Это свидетельствовало о том, что тяжелый атрофический гастрит служит фоном для возникновения MALT-лимфомы. Еще у 15 (30,6%) больных определялся ХГ II стадии. У всех 49 (100%) пациентов с MALT-лимфомой вне зоны опухолевого очага обнаруживались различной степени выраженности инфильтративные изменения СОЖ мононуклеарными и нейтрофильными лейкоцитами, определяющие степень ХГ: I степень - у 24 (49%), II степень - у 17 (34,7%), III степень - у 8 (16,3%) лиц. У всех 49 пациентов с MALT-лимфомой диагностировалась различной степени выраженности кишечная метаплазия: незначительная - у 12 (24,5%), умеренная - у 25 (51%), выраженная - у 12 (24,5%) лиц. При этом у 33 (67,3%) больных определялась полная кишечная метаплазия, а у 16 (32,7%) - неполная. У 45 (91,8%) лиц верифицировалась различной степени выраженности дисплазия эпителия: у 20 (40,8%) - I ст., у 18 (36,7%) - II ст., у 7 (14,3%) - III ст. При сопоставлении результатов гистологического анализа СОЖ вне зоны опухолевого роста у пациентов с I и II стадиями MALT-лимфомы в частоте выявления тех или иных изменений достоверной разницы не обнаруживалось. Сопоставление результатов морфологического исследования СОЖ у пациентов с MALT-лимфомой и у больных с ХГ определяло достоверное увеличение стадии гастрита, дисплазии и кишечной метаплазии желудочного эпителия по мере нарастания степени ЛГ, достигающих наибольших значений при мальтоме желудка. При этом определялась сильная ассоциативная связь между MALT-лимфомой и кишечной метаплазией (r=0,73) и умеренная - между MALT-лимфомой и дисплазией эпителия СОЖ (r=0,59) (таблица 1). Проведенные иммуногистохимические исследования свидетельствовали о нарастании площади экспрессии Ki-67 в эпителиальных клетках у пациентов с ХАГ. Показано, что площадь экспрессии Ki-67 в СОЖ у пациентов с ХАГ и ЛГ I и II степени достоверно превышает таковую у больных с ХНГ и ЛГ I-II степени (р<0,05), а площадь экспрессии Ki-67 у больных с ХАГ и ЛГ III-IV степени достоверно превышает таковую у больных с ХАГ и ЛГ I-II степени (р<0,05). При этом площадь экспрессии Ki-67 в эпителии СОЖ у пациентов с MALT-лимфомой превышает таковую у больных с ХАГ, как с ЛГ I-II степени, так и с ЛГ III-IV степени (р<0,05), а оптическая плотность экспрессии Ki-67 у пациентов с ХАГ и ЛГ I-II степени достоверно не отличается от таковой при ХНГ и ЛГ I-II степени. У пациентов с ХАГ и ЛГ III-IV степени и у лиц с MALT-лимфомой оптическая плотность экспрессии Ki-67 превышала таковую у пациентов с ХНГ и ЛГ I-II степени (р<0,05). При ХАГ и ЛГ I-II степени наблюдалось достоверное увеличение экспрессии р53 в эпителии СОЖ (р<0,05). По мере увеличения степени ЛГ экспрессия р53 в эпителии СОЖ усиливалась, достигая максимальных значений у больных с MALT-лимфомой (р<0,05). В свою очередь, оптическая плотность экспрессии р53 достоверно превышала соответствующее значение у больных с ХНГ и ЛГ I-II степени только у пациентов с MALT-лимфомой желудка (р0,05). Площадь экспрессии Bcl-2 в СОЖ достоверно нарастала у пациентов с ХАГ и ЛГ III-IV степени и MALT-лимфоме (р0,05). Аналогичная закономерность отмечалась и в нарастании оптической плотности экспрессии Bcl-2. Нарастание экспрессии Ki-67, р53 и Bcl-2 в эпителии СОЖ по мере увеличения степени ЛГ, достигающей максимальных значений при MALT-лимфоме, объяснялась наличием более глубоких стадий гастрита, чаще регистрируемыми кишечной метаплазии и дисплазии при ЛГ III-IV ст. и мальтоме желудка (таблица 2). Анализ экспрессии маркеров клеточного обновления в лимфоидной ткани СОЖ показал отсутствие их достоверных различий (р0,05) у пациентов с ЛГ I-II степени при ХНГ и ХАГ. У пациентов с ЛГ III-IV степени определялось достоверное нарастание площадей экспрессии и оптической плотности экспрессии Ki-67 и Bcl-2, а также площади экспрессии р53. В очаге MALT-лимфомы верифицировалось достоверное увеличение площади экспрессии Ki-67, Bcl-2 и р53 по сравнению с ХАГ и ЛГ III-IV степени. При этом увеличения оптической плотности экспрессии указанных показателей не обнаруживалось. Полученные данные свидетельствуют о схожести нарушений экспрессии основных молекул клеточного гомеостаза (Ki-67, p53, Всl-2) как в лимфоидной, так и в эпителиальной ткани СОЖ, что показывает общность механизмов их изменений под влиянием длительно персистирующей H. pylori-инфекции. Мы наблюдали достоверное увеличение площади экспрессии Ki-67, р53 и Bcl-2 в лимфоидной ткани ЛГ III-IV ст. по сравнению с ЛГ I-II ст. и достоверное увеличение площади экспрессии Ki-67, p53 и Bcl-2 в MALT-лимфоме по сравнению с ЛГ III-IV ст. Верифицировалось увеличение оптической плотности экспрессии указанных молекул по мере нарастания степени ЛГ (таблица 3). Заключение Таким образом, MALT-лимфома желудка характеризуется неспецифичностью жалоб и длительным анамнезом диспепсического синдрома. Характер эндоскопической формы MALT-лимфомы зависит от стадии заболевания. Для MALT-лимфомы I стадии наиболее характерной является гастритоподобная форма (47,4%), а для MALT-лимфомы II стадии - язвенная форма (63,3%) опухоли. У H. pylori-инфицированных лиц MALT-лимфома желудка во всех случаях развивается на фоне хронического атрофического антрального гастрита с кишечной метаплазией. При этом у 40,8% пациентов диагностируется IV стадия, у 28,6% - III стадия и у 30,6% больных II стадия хронического гастрита. У 91,8% больных верифицируется различной степени выраженности дисплазия эпителия: у 14,3% - тяжелая, у 36,7% - умеренная и у 40,8% - легкая. Развитие MALT-лимфомы происходит на фоне III и IV стадии гастрита, что ассоциируется с высокими показателями экспрессии Ki-67, Bcl-2 и p53 в эпителии и лимфоидных элементах слизистой оболочки желудка, достоверно превышающими (р0,05) таковые у лиц с хроническим гастритом. У лиц с лимфоидной гиперплазией III и IV степени определяются более тяжелые стадии гастрита, по сравнению с лицами с лимфоидной гиперплазией I и II степени, что ассоциируется с достоверно (р0,05) более высокими показателями экспрессии Ki-67, p53 и Bcl-2 как в эпителиоцитах, так и в лимфоидных элементах слизистой оболочки желудка.

About the authors

JU V KOSTALANOVA

Samara State Medical University; Samara Regional Clinical Oncology Center

Email: kostalanova@yandex.ru

S V KOZLOV

Samara State Medical University

Email: KozlovSV@samaraonko.ru

I L DAVYDKIN

Samara State Medical University

Email: dagi2006@mail.ru

References

Supplementary files