PROTEIN FRACTIONAL COMPOSITION AND MOLECULAR FORMS OF MALATE DEHYDROGENASE IN THE PLANT FRUITS OF THE GENUS FILIPENDULA

Abstract

The investigation of protein fractional composition was performed by means of electrophoresis with polyacrylamide gel. Malate dehydrogenase molecular composition of fresh and dried herbal material of meadowsweet in the humid environment was revealed.

Full Text

К растениям, из которых созданы лекарственные препараты (ЛП), относятся лабазник вязолистный и шестилепестный. При изготовлении ЛП используются различные органы растений указанных видов. Однако препараты на основе плодов лабазника в настоящее время на фармацевтическом рынке Российской Федерации отсутствуют [2]. В связи с этим представляет научный интерес исследование плодов этого растения, и становится актуальным решение вопросов стандартизации лекарственного сырья и препаратов на его основе. К примеру, в процессе высушивания лекарственного растительного сырья белки, содержащиеся в нём, теряют гидратную оболочку, при этом нарушаются четвертичная, третичная структура молекулы и биологическая активность. При формировании оптимальных значений температуры, рН и влажности происходит ренатурация белка с восстановлением первоначальной конформации и каталитической функции энзима. Это приводит к снижению количества действующих веществ и терапевтического действия препарата. В связи с этим очевидна актуальность исследования биохимических характеристик ЛРС, в частности, изучение состава и динамики молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (МДГ) [1, 2]. Цель: исследование фракционного состава белков и молекулярных форм малатдегидрогеназы в плодах двух видов лабазника (вязолистного и шестилепестного) в условиях повышенной влажности. Материалы и методы исследования Материалом исследования служили плоды лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного, заготовленные в фазу плодоношения в 2015 году в Самарской и Ульяновской областях. Электрофоретический анализ проводили в камере для электрофореза в плоских блоках полиакриламидного геля с циркуляционной системой охлаждения. Определение проводили с использованием свежего ЛРС, а также сухого ЛРС после экспозиции во влажных условиях в течение 24, 72 и 120 часов при температуре 200С. Для установления фракционного состава неферментных белков клеток растений гелевые пластинки после электрофореза погружали в 1%-ый раствор амидо-черного в 7 %-ой кислоте уксусной на 10 мин. Для определения МДГ использовалась оптимизированная инкубационная среда: водный раствор NAD (1 мг/мл) - 40 мл, нитросиний тетразолиевый (1 мг/мл) - 30 мл, 1 М раствор малата натрия (рН=7,0) - 10 мл, феназинметасульфат (1 мг/мл) - 4 мл, 0,2 М трис-HCl буферный раствор (рН =7,1) - до 100 мл. Гелевые пластины инкубировали 12 часов при 37°С. Определение относительной электрофоретической подвижности белковых фракций проводили с помощью компьютерной программы TLC Manager v.3.12. Результаты исследования и их обсуждение В результате электрофоретического анализа извлечения из свежих плодов лабазника шестилепестного выявлено наличие высокомолекулярных неферментативных белков с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП), равной 0,25, и неферментативных низкомолекулярных белков с ОЭП 0,90. В ходе эксперимента с высушенным лекарственным растительным сырьем, экспозиционированным во влажной среде при комнатной температуре, были установлены следующие закономерности для плодов лабазника шестилепестного: через 24 часа выявляются высокомолекулярные белки с ОЭП 0,19 и неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,75. Фракция с ОЭП 0,75 обнаруживается также через 72 часа и 120 часов. Фракция с ОЭП 0,20 обнаруживается через 120 часов (рис. 1). В извлечениях из свежих плодов лабазника вязолистного нами были выявлены высокомолекулярные неферментативные белки с ОЭП 0,24 и неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,80. В ходе эксперимента с высушенным лекарственным растительным сырьем, экспозиционированным во влажной среде при комнатной температуре, были установлены следующие закономерности для плодов лабазника вязолистного: через 24 часа выявляются неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,57 и ОЭП 0,85. Фракция с ОЭП 0,75 обнаруживается также через 72 часа и 120 часов (рис. 2). Результаты относительной электрофоретической подвижности извлечений из плодов лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного представлены в таблице 1. Проведенный нами электрофоретический анализ молекулярных форм малатдегидрогеназы, основанный на способности заряженных молекул фермента перемещаться в электрическом поле, позволил обнаружить в свежих плодах лабазника шестилепестного две молекулярные формы этого фермента - МДГ-1 и МДГ-3 (табл. 2). МДГ-3 в плодах лабазника вязолистного активна в свежем сырье и в воздушно-сухом сырье, после предварительной инкубации его в течение 3-х суток во влажной среде (рис. 3). При инкубации воздушно-сухого сырья во влажной среде менее и более трёх суток МДГ-3 не определяется, активна МДГ-1. В плодах лабазника вязолистного наибольшую активность проявляет МДГ-3 как в свежем сырье, так и при инкубации сырья 24 и 72 часа. Через 5 суток свою активность проявляет МДГ-1. В плодах лабазника шестилепестного проявляют свою активность МДГ-1 и МДГ-3. В свежем сырье, а также при инкубации высушенного сырья в течение 72 часов активна МДГ-3 (рис. 4). Полосы МДГ-1 наблюдаются лишь в высушенном сырье плодов при инкубации сырья в течение 24 часов и 120 часов. Заключение В плодах лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного выявлено наличие высокомолекулярных и низкомолекулярных неферментативных белковых фракций. Изменение числа фракций неферментативных белков в растениях семейства Filipendula в условиях повышенной влажности отличается специфичностью для каждого растения и является показателем качества лекарственного растительного сырья. В плодах лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного выявлены две молекулярные формы фермента малатдегидрогеназы - МДГ-1 и МДГ-3. Динамика активности молекулярных форм малатдегидрогеназы в вышеуказанных растениях в условиях повышенной влажности носит индивидуальный характер и может быть использована как критерий подлинности и качества ЛРС. Показано, что сушку данного лекарственного растительного сырья следует проводить при оптимально повышенной температуре для ингибирования ферментов и сохранения действующих веществ. Получено экспериментальное подтверждение необходимости хранения лекарственного растительного сырья в сухих и прохладных помещениях.