Evaluation of bioplastic material Hyamatrix in vitro on the culture of mesenchymal stromal cells of human bone marrow

Full Text

В последние годы регенеративные технологии становятся одной из наиболее наукоемких и динамично развивающихся областей современной медицины. Важнейшим разделом регенеративной медицины является лечение термических поражений дермальных покровов и полноценное восстановление структуры кожи после ожога. Предложен ряд технологий, предполагающих использование как клеточных продуктов, так и бесклеточных биополимерных покрытий натурального происхождения (Островский Н.В. и др., 2007; 2010; Колсанов А.В. и др., 2011). Одним из таких покрытий является Гиаматрикс, содержащий наноструктурированную гиалуроновую кислоту (Рахматуллин Р.Р. и др., 2009). Природа и свойства материала Гиаматрикс позволяют предположить успешность использования его в качестве биоматрицы для клеточных элементов с целью повышения эффективности лечения ожоговых ран. Поэтому изучение влияния Гиаматрикса на культуру мезенхимальных стромальных клеток (МСК) - одного из участника регенераторного процесса - является весьма актуальным. Цель исследования: провести in vitro на культуре МСК человека оценку на цитотоксичность и биосовместимость биоматериала Гиаматрикс. Материалы и методы исследования. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки были получены из костного мозга взрослого человека после подписания информированного согласия на получение биологического материала. Донор был обследован на ВИЧ, RW, гепатит В, С; результаты анализов отрицательные. Было проведено 2 серии эксперимента: опытная - культивирование клеток в присутствии материала Гиаматрикс и контроль - без материала. Длительность эксперимента - 26 суток. Культивирование в обеих группах проводили в одинаковых условиях на пластиковых флаконах (Orange Sciеntific, Бельгия) площадью 25 см2 в питательной среде aMEM (Sigma) с добавлением 2 мM аланил-глютамина (Invitrogen) и 10% отборной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco) при температуре 37º С и концентрации СО2 5% в CO2 инкубаторе (MСО-150, Sanyo, Япония). Клетки в обеих группах вносили в чашки Петри с питательной средой в концентрации 1362 клетки на 1 см2 культурального пластика. Перед исследованием материал Гиаматрикс был регидратирован в стерильном фосфатно-солевом буфере. Перед внесением клеток на пластик в него помещали изучаемый материал размером 0,5х0,5 см. Нативные культуры изучали, фотографировали и проводили морфометрию в динамике с первых суток до 26 дня эксперимента. Оценка площади клеток была выполнена на аппаратно-программном комплексе Axio Observer. A1 (Carl Zeiss) с помощью программного обеспечения Axio Vision. Кластерный анализ - на программном комплексе Image J 1.43m и Image Pro Plus 6.0. Подсчет клеток проводили в начале и в конце эксперимента с использованием аппаратного комплекса Vi-Cell XR, фирмы Becman Coulter. Расчет пролиферативной активности проводили по формуле: Cкорость удвоения культуры (удвоения/ч) рассчитывали по формуле: Для выявления клеток на биоматериале Гиаматрикс проводили окраску ядерным флуоресцентным красителем DAPI и красителем Гимза. Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлюориметре FACS Canto (Becton Dickinson) непосредственно перед посевом и после снятия клеток на 19 и 26 сутки культивирования. Определяли антигены на поверхности клеток с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson): анти CD 90, CD 44, CD 45, CD73, HLA - DR, HLA - ABC, антитела против антигенов CD 34, CD 105, CD 14, меченные фикоэретрином (PE) или флюоресцеинизотиоцианатом (FITC). Для анализа использовали суспензию с содержанием не менее 3х105 клеток, контролем служили клетки, не обработанные антителами. Учитывая однотипность красителей на различных антителах и отсутствие возможности установки компенсации флюоресценции, проводили одноцветный анализ для каждого антитела. Показатели флюоресценции интерпретировали в программе FACS Diva 5.0. Результаты исследования и их обсуждение. В ходе эксперимента мы не обнаружили какого-либо негативного или токсического воздействия исследуемого материала на популяцию клеток, напротив, данные изучения пролиферативной активности свидетельствуют о ее стимуляции. При изучении пролиферативной активности на протяжении всего срока культивирования нам не удалось найти каких-либо значимых различий в исследуемой и испытуемой группе. Морфология клеток оставалась классической фибробластоподобной, то есть клетки имели веретенообразный вид, ровные края и отростки, ядра четкие (рис. 1). Клетки в контрольных образцах достигли монослоя на 19 сутки культивирования, в образцах с добавлением биоматериала Гиаматрикс - на 26 сутки. Это связанно с тем, что при посеве клеток в присутствии исследуемого биоматериала часть клеток адгезировалась к Гиаматриксу, тем самым снижая плотность посева на пластике, что способствовало увеличению времени получения монослоя. Отдельно следует отметить, что исследуемый материал не был прикреплен и при перемещении культуральной посуды от инкубатора к микроскопу свободно смещался, повреждая культуру клеток. Согласно данным кластерного анализа, мы выделили две группы клеток - пролиферативно активные, включающие в себя незрелые и взрослые клетки и пролиферативно не активные, включающие в себя гигантские клетки (Волчков С.Е., 2010). В ходе постоянного изучения кластерного анализа мы обнаружили, что в опытных образцах процент пролиферативно активных клеток был несколько выше, чем в контрольном образце, а группа пролиферативно неактивных клеток ниже (таблица 1). Полученные данные свидетельствуют о более высокой пролиферативной активности культуры клеток в присутствии изучаемого материла Гиаматрикс. В группе с применением биоматериала скорость удвоения составила 0,01 удвоения/ч при общем количестве удвоений 5,73. В то же время в контрольных образцах скорость удвоения составила 0,01 удвоения/ч, при общем количестве удвоений 4,57, то есть ниже, чем в группе с добавлением материала Гиаматрикс, что коррелирует с данными о пролиферативной активности на основе кластерного анализа (таблица 2). Для выявления клеток на исследуемом материале была выполнена окраска красителем Гимза на 26 сутки культивирования. После окраски на участках истончения материала достаточно четко визуализировались ядра клеток (рис. 2). Также была произведена окраска клеток ядерным красителем DAPI на 26 сутки культивирования. В результате окрашивания в местах истончения биоматериала на его поверхности четко визуализировались ядра клеток (рис. 3). На 19 и 26 сутки культивирования проводили оценку экспрессии поверхностных антигенов (CD90,44,45,HLA-A BC, HLA-DR, 73,34, 105,14), характерных для мультипотентных мезенхимальных клеток в контрольной группе и всех сериях с материалами. Установлено, что исследуемые клетки в начале и по окончании эксперимента экспрессировали следующие антигены: CD90, CD44, HLA-ABC, CD73, CD105, наличие которых представляет собой характерный признак стромальных клеток (рисунок 4). Наблюдалось отсутствие экспрессии следующих антигенов: CD 45, CD 34, HLA-DR, CD 14, что также подтверждает принадлежность к стромальным клеткам Результаты иммунофенотипического исследования свидетельствовали о стабильной принадлежности исследуемых клеток к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, что подтверждало отсутствие признаков гемопоэтической трансформации и изменений линейного происхождения. Таким образом, применение красителя Гимза с высокой концентрацией красителя в ядрах позволило визуализировать клетки на исследуемом материале. Окраска с помощью DAPI также показала наличие ядер клеток на материале. Максимально большие скопления клеток были выявлены на периферии материала, в центре отмечено менее плотное и более упорядоченное расположение клеток (по ориентации ядер). Вывод. Полученные данные позволили сделать вывод, что исследуемый материал Гиаматрикс является биологически активным, повышая пролиферативный потенциал клеток, обладает биологической совместимостью, обеспечивая адгезию клеток на поверхности, и не оказывает какого-либо влияния на морфологические характеристики клеток.

About the authors

I R Gilmutdinova

References

Supplementary files