FRACTIONAL COMPOSITION OF PROTEINS AND MOLECULAR FORMS OF MALATE DEHYDROGENASE IN THE GRASS OF MEADOWSWEET

Abstract

The paper presents a study of the fractional composition and structure of the set of molecular forms of malate dehydrogenase in fresh and dried medicinal plants - herbs of meadowsweet - in humid environment.

Full Text

В настоящее время до 40% всех лекарственных препаратов, применяемых в современной медицине, получают из растительного материала. По своей фармакологической активности фитопрепараты не уступают своим синтетическим аналогам, а благодаря сбалансированному комплексу биологически активных веществ, они благоприятно действуют на организм человека, практически не давая побочных эффектов [2]. Стандартизация лекарственных средств растительного происхождения имеет свои особенности, а проблема сохранения действующих веществ в лекарственном растительном сырье в процессе его сушки и хранения не полностью решена. Однако в процессе высушивания лекарственного растительного сырья (ЛРС) белки теряют гидратную оболочку, при этом нарушаются четвертичная, третичная структура молекулы и биологическая активность. При формировании оптимальных значений температуры, рН и влажности происходит ренатурация белка с восстановлением первоначальной конформации и каталитической функции энзима [3]. Это приводит к снижению количества действующих веществ и терапевтического действия препарата [1, 4]. В связи с этим становится актуальным исследование биохимических характеристик ЛРС, в частности изучение состава и динамики молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (МДГ). Имеются данные о том, что малат играет существенную роль в поддержании внутренних физиологических условий растительных клеток. Двойной путь утилизации малата с помощью малатдегидрогеназ (МДГ) и малик-энзимов позволяет организму уменьшить зависимость от гликозида при синтезе энергии и углеродных скелетов. Растительная МДГ (малатдегидрогеназная система) представляет собой динамическое равновесие белков, способное четко реагировать на физиологическое состояние и потребности растительного организма, а также изменение окружающей среды. Мататдегидрогеназный комплекс представлен четырьмя дегидрогеназами, две из которых обладают оксидоредуктазной активностью, а две другие - декарбоксилирующие МДГ [5]. В современной литературе данные о МФ МДГ лекарственных растений немногочисленны. Поэтому настоящее исследование приобретает важное теоретическое и практическое значение. Цель исследования: установить фракционный состав белков и молекулярные формы малатдегидрогеназы в траве лабазника вязолистного и шестилепестного. Материалы и методы исследования Объектом исследования являлась трава лабазника вязолистного и шестилепестного, заготовленная в Самарской области в 2014 году. Для выполнения исследований использовали электрофоретический метод анализа. Определение проводили с использованием свежего ЛРС, а также сухого ЛРС после экспозиции во влажных условиях в течение 24, 72 и 120 часов при температуре 200С. Для установления фракционного состава неферментных белков клеток растений гелевые пластинки после электрофореза погружали в 1% раствор амидочерного в 7% кислоте уксусной на 10 мин. Избыток красителя удаляли вымачиванием гелевых пластинок в 7% кислоте уксусной в течение 7 дней. Молекулярные формы МДГ разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле и выявляли феназинметасульфат-тетразолиевой реакцией: гелевые пластины инкубировали 12 часов при 37°С в чашках Петри в оптимизированной инкубационной среде, содержащей водные растворы NAD (1 мг/мл) - 40 мл, нитросинего тетразолиевого (1 мг/мл) - 30 мл, 1 М раствора малата натрия (рН=7,0) - 10 мл, феназинметасульфата (1 мг/мл) - 4 мл, 0,2 М трис-HCl буферного раствора (рН=7,1) - до 100 мл. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих полос. Результаты исследования и их обсуждение При проведении электрофоретического анализа во всех извлечениях из свежего растительного сырья травы лабазника вязолистного и шестилепестного обнаружены низкомолекулярные белки с высокой электрофоретической подвижностью. На электрофореграммах регистрируются две окрашенные полосы неспецифических белков: в траве лабазника вязолистного обнаруживаются низкомолекулярные белки с ОЭП 0,68-0,75; в траве лабазника шестилепестного с ОЭП 0,65-0,77 (табл. 1). В образце из высушенной травы лабазника шестилепестного обнаруживаются две фракции неспецифических белков с соответствующими значениями относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) 0,42-0,65 и 0,62-0,78 (табл. 1). Выдерживание образцов сырья в условиях повышенной влажности во времени привело к изменению фракционного состава белка. Так, при инкубации сырья в течение 24 часов обнаруживаются неспецифические белки с ОЭП 0,42 и ОЭП 0,62. При более длительном выдерживании сырья в условиях повышенной влажности (72 часа) определяются белки с ОЭП 0,65 и ОЭП 0,78. Через 120 часов на фореграмме белковые фракции не обнаруживаются. Можно предположить, что эти неспецифические белки подверглись катаболизму в реакциях возобновившегося ферментативного катализа. В сырье из высушенной травы лабазника вязолистного обнаруживаются также две фракции неспецифических белков с ОЭП 0,37 и ОЭП 0,52. Выдержка в условиях повышенной влажности играет существенную роль для данного вида сырья, так как через 72 часа инкубации обнаруживается только одна фракция неспецифических белков с ОЭП 0,52. Через 120 часов фракции неспецифических белков не обнаруживаются. Следовательно, можем предположить, что эти белки также подверглись катаболизму в реакциях возобновившегося ферментативного катализа. Проведенный анализ свежего сырья травы лабазника двух видов позволил обнаружить изоформу МДГ, а именно МДГ-3. При проведении данного анализа с сухим сырьем, на фореграмме не обнаруживаются изоформы МДГ. Можно предположить, что произошел катаболизм в реакциях возобновившегося ферментативного катализа (табл. 2). Заключение В траве лабазника вязолистного и шестилепестного обнаружены неспецифические белки и выявлена МФ фермента МДГ, а именно МДГ-3. Изменение числа фракций неферментативных белков и динамика активности молекулярной формы МДГ в растениях семейства розоцветные в условиях повышенной влажности отличаются специфичностью для каждого растения и являются показателем качества лекарственного растительного сырья.